DEL红细胞膜D抗原表位分析

＊采用间接抗人球蛋白试验；？表示结果判度无法认定。
３讨论 ＤＥＬ发现于１９８４年，首个等位基因ＲＨＤｌ２２７Ａ
万方数据
（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ ＡＦ３９０１１０）发现于２００１年。 ２００２年作者实验室通过大样本调查发现中国汉族 ＤＥＬ个体均携带ＲＨＤｌ２２７Ａ等位基因［２。。由于中国 汉族Ｒｈ阴性人群中ＤＥＬ常见，因此对其深入研究对 我国临床输血以及Ｒｈ同种免疫的防治具有重要意 义。
另一方面，尽管ＤＥＬ红细胞膜Ｄ抗原的分子数 目非常少，但２００５年国外已有文献报道ＤＥＬ胎儿或 红细胞，免疫Ｒｈ阴性孕妇或Ｒｈ阴性受血者产生抗一Ｄ 同种免疫反应［３．４］，事实上早在２００１年我国冯双利等 即观察到Ｒｈ阴性患者输注ＤＥＬ红细胞产生抗一Ｄ的 现象口５｜，只是当时并未引起国内外的重视。目前国际 上，包括我国均不检测ＤＥＬ血型，将其视为Ｒｈ阴性 供者凹］，因此深入探讨ＤＥＬ红细胞膜抗原表达情形具 有积极、深远的意义。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
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ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ ９ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ—Ｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａＩ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ
ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｍｏｄｉ“ｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ—ｅｌｕｔｉｏｎ ｔｅｓｔ．Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ Ｒｈ—ｐｏｓｉｔｉｖｅ，Ｒｈ—ｎｅｇａｔｉｖｅ，ａｒｌｄ ｐａｒｔｉａｌ ＤＶａ
２ 结果
３名个体均为以往采用人源抗一Ｄ血清通过常规
吸收放散试验证实为Ｒｈ血型Ｄ放散型，本次研究通
过改良的微量吸收放散技术，同样采用人源抗一Ｄ血 清，并以Ｒｈ阴性、部分Ｄ表型ＤⅦ（Ｈｕｓ）和ＤＶＩⅢ型
样本各一份作为对照，结果显示Ｄ放散型样本与以往
试验结论一致，对照样本亦未见矛盾结果，说明经过改 良的微量吸收放散试验简便可行。
国外医学输血及血液学分册２００６年第２９卷第３期
ＤＥＬ红细胞膜Ｄ抗原表位分析
·１９３·
·论著·
邵超鹏 苏宇清 熊文 张印则 李桢 周丹
【摘要】 目的 分析Ｒｈ血型Ｄ放散型（ＤＥＬ）红细胞膜Ｄ抗原表位（ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉ“ｇ）。方法 采用 微量吸收放散技术通过９种抗Ｄ抗原不同表位的人抗一Ｄ单克隆抗体，检测３名已知Ｒｈ表型和ＲＨ基因 型的Ｄ放散型个体的红细胞膜Ｄ抗原表位，分别以Ｒｈ阳性、Ｒｈ阴性、部分Ｄ表型ＤＶａ（Ｈｕｓ）和ＤＶＩⅢ型 样本作为对照。结果 ３名携带ＲＨＤｌ２２７Ａ等位基因的Ｄ放散型个体，红细胞膜Ｄ抗原９个抗原表位均 检测为阳性，而对照样本检测结果各不相同。结论携带ＲＨＤｌ２２７Ａ等位基因的中国汉族Ｄ放散型个体 红细胞膜可能表达基本完整Ｄ抗原。
进一步证实本文的结论具有重要的临床意义，因 为根据免疫学的基本原理，若ＤＥＬ红细胞膜表达完整 的Ｄ抗原，ＤＥＬ个体将可能不会被Ｄ抗原免疫产生 同种免疫反应，即ＤＥＬ患者可以输注Ｒｈ阳性红细 胞，ＤＥＬ女性妊娠Ｒｈ阳性胎儿将可能不会面临发生 新生儿溶血病的风险。临床约三成的Ｒｈ阴性患者（可 能为Ｄ放散型）将无需等待Ｒｈ阴性血液，不仅缓解了 Ｒｈ阴性血源紧张的局面，而且这些患者更不会因为等 待Ｒｈ阴性稀有血液而延误治疗。当然，本文的结果和 结论尚需进一步采用更多、更全面的抗Ｄ抗原不同表 位的单克隆抗体进行证实，尽管要获得足够的抗Ｄ抗 原不同表位的单克隆抗体试剂十分困难；同时还必须 完整阐明分子生物学原理；并通过临床观察，如ＤＥＬ 女性妊娠Ｒｈ阳性胎儿同种免疫反应跟踪观察等。
国外医学输血及血液学分册２００６年第２９卷第３期
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４参考文献
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【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｒｈ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ； ＤＥＬ； ａｎｔｉｇｅｎ ｅｐｉｔｏｐｅ； ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｒｈ血型是人类最复杂的红细胞血型系统，在Ｉ临床 输血中其重要性仅次于ＡＢＯ血型，Ｒｈ血型Ｄ抗原则 是引起严重新生儿溶血病的主要红细胞抗原。Ｄ抗原 有多种变异体，如弱Ｄ型、部分Ｄ型、Ｄ放散型（ＤＥＬ） 等。ＤＥＬ红细胞膜Ｄ抗原非常弱，常规间接抗人球蛋 白试验（ＩＡＴ）测定为阴性，只有通过敏感的吸收放散 技术才能检出。ＤＥＬ在不同民族中表型频率差别较 大，如在高加索人中约为ｏ．１６％［１］，黑人中尚未观察 到，而在中国汉族Ｒｈ阴性人群中比例高达２６％左 右［２］。目前国际上共发现５种Ｄ昱￡等位基因［１‘４］，但有 数据表明中国汉族人群中只存在一种等位基因 ＲＨＤｌ２２７Ａ＿２’５ｊ。过去十六、七年间，Ｒｈ血型分子生物 学研究取得了一系列重大突破，而２００５年则几乎成为 ＤＥＬ研究的热点年，国内、国外均有不少研究深入探 讨ＤＥＬ形成的分子机制及红细胞膜Ｄ抗原性质等。 本文主要研究以中国汉族人群为主、携带ＲＨＤｌ２２７Ａ 等位基因的ＤＥＬ型，其红细胞膜Ｄ抗原的表位图谱， 并与正常Ｄ抗原及部分Ｄ表型抗原比较。
国外医学输血及血液学分册２００６年第２９卷第３期
本的吸收放散实验，因此我们采用１．５ ｍＬ Ｕ形底塑 料离心管，加压积红细胞约１００肛Ｌ，抗一Ｄ抗体１５０弘Ｌ， ３７℃吸收３０ ｍｉｎ，温水充分洗涤６～７遍至上清ＩＡＴ 试验抗一Ｄ测定为阴性，最后一次去净上清液，加１００ 弘Ｌ生理盐水混合，置５６℃放散６ ｍｉｎ，立即３０００ ｒｐｍ 离心１ ｍｉｎ，取上清分别与１份Ｒｈ阴性和ｌ份Ｒｈ阳 性红细胞进行ＩＡＴ试验［９］。ＩＡＴ亦采用“半量法”进 行，即２５肛Ｌ ５％的红细胞悬液加２５肛Ｌ上清液３７℃ 反应３０ ｍｉｎ后洗涤３次，去净上清后红细胞加２５肛Ｌ 抗人球蛋白抗体（ＤｉａＭｅｄ）混合离心，肉眼和显微镜观 察结果。
测结果全部为阳性（见表１），这一结果提示携带 ＲＨＤｌ２２７Ａ等位基因中国汉族Ｄ放散型个体的红细
胞膜可能具有完整的Ｄ抗原表达，但进一步结论需要
采用更多、更全面的抗Ｄ抗原不同表位的单克隆抗体
进行测定。
、
表１不同人抗一Ｄ单克隆抗体与Ｄ抗原变异体的反应格局
（：童） 人抗Ｄ单抗 检测Ｄ表位
Ｄ ｖ１Ⅲ
ＤＥＬ Ｒｈ（一）Ｒｈ（＋）＊
（Ｈｕｓ）ａｎｄ ＤＶＩ ＩＩＩ ｄｏｎｏｒｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｔｅｓｔｅｄ ａｓ ｃｏｎｔｒ０１ｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｌｌ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｗｅｒｅ
ｔｅｓｔｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎ ａｌｌ ３ ＤＥＩ。ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ Ｒ．ＨＤｌ２２７Ａ ａｌｌｅｌｅｓ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒ０１ ｓａｍｐｌｅｓ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ
９种单克隆抗体的ＩＡＴ试验检测Ｒｈ阳性红细胞
均为阳性，而微量吸收放散试验结果则显示Ｒｈ阴性 红细胞则全部为阴性，２例部分Ｄ表型样本ＤⅥ（Ｈｕｓ）
和ＤｖｌⅢ型的检测结果与以往报道的各自Ｄ抗原表位
的缺失情形基本一致［１１；３名携带ＲＨＤｌ２２７Ａ等位基 因的Ｄ放散型个体的红细胞膜Ｄ抗原，与９种抗Ｄ抗
原不同表位的人抗一Ｄ单克隆抗体的微量吸收放散检
红细胞膜Ｄ抗原包含许多不同的抗原表位 （ｅｐｉｔｏｐｅｓ），其经典的划分方法是分为８个Ｄ抗原表 位，即ｅｐｉｌ～ｅｐｉ９（取消了第７表位）［１１｜，其后国际输血 协会归纳和总结各实验室制备的新的抗一Ｄ单克隆抗 体，在此８个表位的基础上，进一步细分不同的亚位 点，共３０个Ｄ抗原表位［１ ２｜，本文所选择的９个单克隆 抗体则覆盖全部８个粗分Ｄ抗原表位。结果３份ＤＥＬ 个体的红细胞均与全部９个单克隆抗体反应，显然提 示ＤＥＬ可能拥有基本完整的Ｄ抗原，但这一结论却 与ＤＥＬ分子机制的研究结果相矛盾。最新分子研究表 明［１３’１“，ＤＥＬ基因转录后发生错误剪切，使成熟的 ｍＲＮＡ完整失去基因第９外显子对应的序列，翻译截 断的ＲｈＤ蛋白。作者认为血清学结果与分子生物学矛 盾最可能的解释是，ＲｈＤ蛋白对应基因第９外显子的 氨基酸序列为跨膜区，因此并没有完全影响ＤＥＬ红细 胞膜Ｄ抗原决定簇或表位的形成。
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ａ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｏｒ Ｒｈ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ＤＥＬ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ３ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ３ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｋｎｏｗｎ Ｒｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ Ｒ爿
ｌ材料方法
１．１研究对象３名个体均为深圳市血液中心的无
作者单位：５１８０３５深圳市血液中心
万方数据
偿献血者，汉族，女性，年龄３０～３８岁，均经间接抗人 球蛋白试验确认为Ｒｈ阴性，并通过吸收放散试验鉴 定为Ｄ放散型，同时进行ＲＨＤ基因全长编码区序列 分析［２’６］，以及进行个体尺ＨＤ合子型分析［２’６’…。其中 １名个体Ｒｈ表型为Ｄ＋Ｃ＋ｃ＋Ｅ—ｅ＋（ＤＣｃｅｅ），２名为 Ｄ＋Ｃ＋ｃ—Ｅ—ｅ＋（ＤＣＣｅｅ），合子型分析显示基因型分别 为Ｄ＆／ｄｆＰ、ＤＩ％／Ｄ＆、ＤＩ％／矗＆。对照样本Ｒｈ阳性、 Ｒｈ阴性、部分Ｄ表型ＤＶａ（Ｈｕｓ）和ＤＶＩⅢ型亦经 ＩＡＴ、吸收放散试验鉴定，以及进行尺ＨＤ基因全长编 码区序列分析和ＲＨＤ合子型测定，分别见文献聃］。 １．２人抗一Ｄ单克隆抗体 本实验室使用的抗体均为 人抗一Ｄ单克隆抗体，共９种，其中克隆株Ｐ３ｘ２４９、 Ｐ３ｘ２９０、Ｐ３ｘ３５、Ｐ３ｘ２４１、ＨＭｌ０、Ｐ３ｘ２１２一１１Ｆ１ 和 Ｐ３ｘ２１２—２３Ｂｌｏ为Ｄｉａｇａｓｔ公司产品（Ｄｉａｇａｓｔ，Ｌｏｏｓ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ，Ｐ３ｘ２９０和ＨＭｌｏ分别为德国和香港 友人赠送）；单克隆抗体ＬＨＭ７０／４５和ＥＳＤｌ为 ＤｉａＭｅｄ公司产品（ＤｉａＭｅｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）。 人抗一Ｄ血清购自中国医学科学院输血研究所。９张人 抗一Ｄ单克隆抗体分别特异性针对Ｄ抗原１～９表位 （无第７表位），各表位的亚位点分别于表１中用小数 点表示，详见表１。 １－３微量吸收放散试验 由于上述稀有抗体获赠量 或所能购买的量均很小，不足完成多份样本及对照样
【关键词】Ｒｈ血型；Ｄ放散型；抗原表位； 单克隆抗体
Ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｆｏｒ Ｒｈｅｓｕｓ Ｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ＤＥＬ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ＳＨＡｏ Ｃ＾盘Ｄ一户Ｐ九ｇ，５Ｕ ｙ“一ｇｉ咒ｇ，ＸｊＯⅣＧ Ｉ矿Ｐ起，ＺＨＡⅣＧ ｙ；押一ｇ已，ＬＪ Ｚ＾ｅｎ，Ｚ日ｏＵ Ｄ以行，５＾Ｐ卵ｚ＾Ｐ” ＢＺｏｏｄ Ｉ！■以抬ｒ，５＾Ｐ以ｚ＾Ｐ卵５ １８０３５，Ｃ＾ｉ孢ｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
Ｔｈｅ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｍａｙ ｈａｖｅ ｇｒｏｓｓｌｙ ｃｏｍｐｌｅｔｅ【）ａｎｔｉｇｅｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ＤＥＬ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｒ日Ｄ１２２７４ ａｌｌｅｌｅｓ．