红曲米糖化酶提取工艺及其糖化力测定方法选优_林晓婕

摘 要：研究了固液比、提取温度和时间对制备的福 建 红 曲 米 粗 酶 液 酶 活 的 影 响 ， 比 较 了 以 碘 量 法、ＤＮＳ 法 和 菲林试剂法的红曲米糖化力测定结果，并进行红曲黄酒酿造验证糖化力检测试验。结果表明，红曲米糖化酶最
佳提取方式为选择固液比 （ｍ∶Ｖ） ＝１ｇ∶２５ｍＬ，红曲米粉末于缓冲液溶解摇匀后立即过滤，取滤液检测。碘量 法与 ＤＮＳ法均为红曲米糖化酶适宜的检测方法，两种方法检测数据具 有 可 比 性。 从 时 效 性 考 虑， 碘 量 法 适 宜 少
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｉｆｙｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｑｕ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ｒｉｃｅ Ｗｉｎｅ
ＬＩＮ Ｘｉａｏ－ｊｉｅ１，２，ＬＩＡＮＧ Ｚｈａｎｇ－ｃｈｅｎｇ１，２，ＨＵＡＮＧ Ｆｅｉ １，２，ＲＥＮ Ｘｉａｎｇ－ｙｕｎ１，２，ＬＩＮ Ｘｉａｏ－ｚｉ １，２，ＨＥ Ｚｈｉ－ｇａｎｇ１，２＊ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｕｊｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｊｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３５００１３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｆｕｊｉａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ （Ｆｏｏｄ）Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３５００１３，Ｃｈｉｎａ）
金 Ｃ 类 （２０１５ＱＣ－９）
第８期
林晓婕等：红曲米糖化酶提取工艺及其糖化力测定方法选优
８９３
同，高温长时的提取方法有可能造成酶活损失。同 时，测定糖化力的方法有很多，国标针对糖化酶制 剂采用碘量法 ， ［５］ 该方法准确可靠，操作复 杂， 尤 其在处理大量样品时，分析速度慢，对糖化力较低 的样品 则 颜 色 变 化 不 明 显， 判 断 误 差 较 大； 胡 卫 明 、 ［６］ 马耀宏 等 ［７］ 采用菲林试剂法，此法应 用 较 为 广泛，但张凤英 等 ［８］ 认为其影响因素较多，且 操 作 繁琐、时间长，测定技术要求高，结果差异大；白 利涛 、 ［９］ 马歌丽 等 ［１０］ 研究 了 ＤＮＳ 法 测 定 糖 化 酶 活 力，认为 ＤＮＳ法和 碘 量 法 在 精 密 度 和 正 确 度 上 都 无显著差异，操作简便，对于多个样品可实现快速 测定；许明 明 等 ［１１］ 采 用 试 饭 法 直 接 测 定。 本 研 究 考察了固液比、提取温度和提取时间对粗酶提取液 酶活的影 响， 同 时 对 比 了 碘 量 法、ＤＮＳ 法 和 菲 林 试剂法，并对酿造红曲米糖化力检测进行了验证试 验，以期为酿造红曲米检测技术规程的制订以及红 曲米糖化力评价提供科学依据。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｉｄ－ｔｏ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ ｒｉｃｅ ｗｉｎｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ；ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ，ｉｏｄｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ，ＤＮＳ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｆｅｈｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ；ａｎｄ ｔｈｅ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｑｕ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ ｒｉｃｅ ｗｉｎｅ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｖｅｒｉｆｉｅｄ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓａｃｃｈａｒｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ：ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ－ｔｏ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ （ｍ／Ｖ ）ｏｆ １ ｇ ∶ ２５ ｍＬ，ｔｈｅ ｐｏｗｄｅｒ ｏｆ Ｑｕ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ ｒｉｃｅ ｗｉｎｅ ｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｈａｋｅｄ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ，ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ．Ｂｏｔｈ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｈｏｎｇｑｕ ｇｌｕｔｉｎｏｕｓ ｒｉｃｅ ｗｉｎｅ，ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．Ｉｏｄｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｆ ｉｔ ｉｓ ｓｍａｌｌ ｓａｍｐｌｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ；ＤＮＳ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｆ ｉｔ ｉｓ ｂｉｇ ｓａｍｐｌｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ．Ｄｕｒｉｎｇ Ｈｏｎｇｑｕｇｌｕｔｉｎｏｕｓ ｒｉｃｅ ｗｉｎｅｔｅｓｔ ａｎｄ ｖｅｒｉｆｙ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｐａｉｎｔ ａ ｓｉｍｉｌａｒ ｐｉｃｔｕｒｅ ｗｉｔｈｔｈｅ ｗｉｎｅ ｙｉｅｌｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｑｕ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ ｒｉｃｅ ｗｉｎｅ；ｓａｃｃｈａｒｉｆｙｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ；ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ
量样品测定，ＤＮＳ法适宜用于快速测定多个样品。经酿造 验 证，红 曲 米 糖 化 力 的 测 定 值 与 以 其 为 糖 化 剂 的 黄 酒
出酒率检测结果是一致。
关键词：红曲米；糖化酶；糖化力
中 图 分 类 号 ：ＴＳ ２６１．２
文 献 标 识 码 ：Ａ
文章编号：１００８－０３８４ （２０１６）０８－８９２－０５
红曲米是我国传统发酵食品，以籼稻、粳稻、 糯米等稻米为原料，用红曲霉菌发酵而成，在酿造 福建黄酒过程中，发挥了提供色泽、风味和糖化等 作用 。 ［１－２］ 糖化力是衡量红曲 米 糖 化 力 作 用 强 弱 的 一个重要指标。然而，如何判断红曲米糖化力强弱
至今没有统一标准。糖化酶提取方法直接影响到红 曲米糖化力测定的高低，提取方式就有很多种，如 温小英 等 ［３］ 采 用 ３５℃ 浸 提 １ｈ 的 方 法 提 取， 汪 志 君［４］等采用３０℃浸提１ｈ， 马 歌 丽 等 ［８］ 采 用 缓 冲 液 直接提取。 不 同 的 提 取 方 法 对 糖 化 酶 活 力 影 响 不
１ 材料与方法
１．１ 原 料 红曲米，由福建永春、平湖、三明、宁德等地
收集。 １．２ 仪 器 与 药 品
ＧＸ－０４多功能粉 碎 机， 上 海 高 翔 食 品 机 械 厂； 电热恒温水 浴 锅；ＢＳ２２４Ｓ 电 子 天 平， 赛 多 利 斯 科 学仪器。 １．３ 试 验 方 法 １．３．１ 试剂 ０．０５ ｍｏｌ·Ｌ－１ 乙 酸－乙 酸 钠 缓 冲 溶 液 （ｐＨ４．６），ＤＮＳ试剂，２００ｇ·－１氢氧化钠，２０ ｇ· －１可 溶 性 淀 粉 溶 液 ，０．１％ 葡 萄 糖 标 准 溶 液 。 １．３．２ 粗酶液提取 红 曲 米 用 多 功 能 粉 碎 机 打 成 粉末 （８０目），精确称取适量 粉 末， 按 试 验 设 计 以 ０．０５ｍｏｌ·Ｌ－１乙酸－乙酸钠缓冲 溶 液 为 溶 剂， 经 一 定温度、时间下浸提后抽滤，洗涤３次，收集滤液 定 容 至 ２５０ ｍＬ， 待 用 。 １．３．３ 单 因 素 试 验 为 了 考 察 固 液 比、 提 取 温 度 和 时 间 对 粗 酶 提 液 酶 活 的 影 响 ， 按 １．３．２ 方 法 进 行 以下３个单 因 素 试 验。 固 液 比 （ｍ／ｇ∶Ｖ／ｍＬ） 分 别 为 １∶１００、１∶５０、１∶２５、２∶２５、３∶２５、４∶ ２５、５∶２５，在４０℃水浴中进行浸提 ４０ ｍｉｎ； 以较 优 固 液 比 ， 在 ４、２０、３０、４０、５０℃ 水 浴 中 浸 提 ４０ ｍｉｎ；以较优固液比， 在 最 适 温 度 水 浴 中 分 别 进 行 浸 提 ０、１０、２０、３０、４０ ｍｉｎ。 每 处 理 重 复 ２ 次 。 １．４ ３ 种 检 测 方 法 比 较 １．４．１ 碘量法 参考 ＧＢ ８２７６－２００６，略作修改。
收 稿 日 期 ：２０１６－０４－１１ 初 稿 ；２０１６－０７－２０ 修 改 稿 作者简介：林晓婕 （１９８２ຫໍສະໝຸດ Baidu），女，硕士，主要从事农产品加工及食品发酵研究
＊通讯作者：何志刚 （１９６４－），男，研究员，主要从事农产品贮藏与加工研究 （Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｊｇｚｘ＠１６３．ｃｏｍ） 基金项目：福建省属公益类科研院所基本科 研 专 项 （２０１４Ｒ１０１５－４，２０１４Ｒ１０１５－５，２０１６Ｒ１０１４－７）、 福 建 省 农 业 科 学 院 青 年 人 才 创 新 基
糖化酶 酶 解： 取 两 支 ５０ ｍＬ 比 色 管 （Ａ、Ｂ 管），分别加入可溶性淀粉溶液１０ｍＬ 和乙酸－乙酸 钠缓 冲 液 ８ ｍＬ， 摇 匀。 于 ４０℃ 恒 温 水 浴 中 预 热 ５ ～１０ｍｉｎ。在 Ｂ 管中加入待测酶液１０．０ｍＬ，立即 记时，摇匀。在此 温 度 下 准 确 反 应 ６０ ｍｉｎ 后， 立 即向 Ａ、Ｂ 管中各加氢氧化钠溶液 ０．２ ｍＬ， 摇 匀， 同时将两管取出，迅速用水冷却，并于 Ａ 管中补 加待测酶液１０．０ｍＬ 作为空白对照。
测定：吸取上述 Ａ、Ｂ 两 管 中 的 反 应 液 各 ５．０ ｍＬ，分别于两 个 碘 量 瓶 中， 准 确 加 入 碘 标 准 溶 液 １０．０ｍＬ，再 加 氢 氧 化 钠 溶 液 １５ ｍＬ， 边 加 边 摇 匀，并于暗处放 置 １５ ｍｉｎ， 取 出。 用 水 淋 洗 瓶 盖， 加入硫酸溶液２ ｍＬ， 用 硫 代 硫 酸 钠 标 准 滴 定 溶 液 滴定蓝紫色溶液，直至刚好无色为其终点，分别记 录空白和 样 品 消 耗 硫 代 硫 酸 钠 标 准 滴 定 溶 液 体 积 （ＶＡ 、ＶＢ ）。
红曲米酶活力单位按下式计算： Ｘ＝（ＶＡ －ＶＢ）×ｃＳＴ ×ｃＧ×（Ｖｔ／Ｖｘ）×（１／１０）×ｎ 式中：Ｘ 为样品的酶活力单位即 １ｇ红曲米在 ４０℃ 、ｐＨ ４．６ 的 条 件 下 ，１ｈ 水 解 可 溶 性 淀 粉 的 产 生１ｍｇ葡萄糖为１ 个 酶 活 力 单 位 （Ｕ·ｇ－１）；ＶＡ 为滴定空白时，消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体 积 （ｍＬ）；ＶＢ 为 滴 定 样 品 时， 消 耗 硫 代 硫 酸 钠 标 准滴定溶液的 体 积 （ｍＬ）；ｃＳＴ 为 硫 代 硫 酸 钠 标 准 滴定溶液的准确 浓 度 （ｍｏｌ·Ｌ－１）；ｃＧ 为 葡 萄 糖 的 摩 尔 质 量，９０．０５ｇ· ｍｏｌ－１；Ｖｔ 为 反 应 液 的 总 体 积，２４．２Ｌ；Ｖｘ为吸取反应液的体积，５Ｌ；ｎ 为稀 释倍数。 １．４．２ ＤＮＳ 法 （１） 标 准 曲 线 制 作： 准 确 称 取 １０５～１１０℃ 干 燥后的葡 萄 糖 ５０ ｍｇ， 用 蒸 馏 水 溶 解， 定 容 至 ５０ ｍＬ 容量瓶中，配 置 成 １ ｍｇ·ｍＬ－１ 标 准 溶 液， 分 别稀释为０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ ｍｇ·ｍＬ－１的 标准 工 作 溶 液， 分 别 吸 取 ０．５ ｍＬ， 分 别 于 在 ２５ ｍＬ 比色管中，加入１．５ｍＬ ＤＮＳ试剂混匀， 在沸 水浴中加 热 ５ ｍｉｎ 后 取 出 迅 速 冷 却 至 室 温， 加 水 １０ｍＬ。以试剂空白作参比，用１ｃｍ 比色皿在５２０ ｎｍ 测定吸光度。以 葡 萄 糖 含 量 为 横 坐 标， 以 吸 光 度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。 （２） 糖化力测定：糖化酶酶解方法与碘量法的 相同测定方法参考马歌丽 、 ［１０］ 孙淑琴 ， ［１２］ 上述 Ａ、 Ｂ 两管 中 的 反 应 液 稀 释 至 ０．５ ｍＬ， 分 别 于 在 ２５ ｍＬ 比色管中，加入１．５ｍＬ ＤＮＳ试剂在沸水 浴 中 加热５ｍｉｎ后 取 出 迅 速 冷 却 至 室 温， 加 水 １０ ｍＬ。 以试剂空白作参比，用１ｃｍ 比色皿在５２０ｎｍ 测定
福建农业学报 ３１（８）：８９２～８９６，２０１６ Ｆｕｊｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｊｎｙｘｂ．ｃｎ ｄｏｉ：１０．１９３０３／ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－０３８４．２０１６．０８．０１９
林晓婕，梁璋成，黄 飞，等．红曲米糖化酶提取工艺及其糖化力测定方法选优 ［Ｊ］．福建农业学报，２０１６，３１ （８）：８９２－８９６． ＬＩＮ Ｘ－Ｊ，ＬＩＡＮＧ Ｚ－Ｃ，ＨＵＡＮＧ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｉｆｙｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｑｕ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ｒｉｃｅ Ｗｉｎｅ［Ｊ］．Ｆｕｊｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１６，３１ （８）：８９２－８９６．
红曲米糖化酶提取工艺及其糖化力测定方法选优
林 晓 婕１，２， 梁 璋 成１，２， 黄 飞１，２， 任 香 芸１，２， 林 晓 姿１，２， 何 志 刚１，２＊
（１．福 建 省 农 业 科 学 院 农 业 工 程 技 术 研 究 所 ， 福 建 福 州 ３５０００３； ２．福建省农产品 （食品） 加工重点实验室，福建 福州 ３５０００３）