细菌内毒素检测方法验证

细菌内毒素检测方法验证方案

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目的-------------------------------------------------------------------------范围-------------------------------------------------------------------------责任人----------------------------------------------------------------------内容-------------------------------------------------------------------------

1.实验材料及用具-------------------------------------------------------

2 实验准备----------------------------------------------------------------

3.具体验证步骤----------------------------------------------------------3.1. 鲎试剂灵敏度复核------------------------------------------------3.2..干扰实验--------------------------------------------------------------

3.3.供试品细菌内毒素检查--------------------------------------------

4.验证结论--------------------------------------------------------------附：

表1.鲎试剂灵敏度复核记录

表2.干扰试验记录

表3.细菌内毒素检查记录

目的：为确保盐酸罗哌卡因一水合物细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。

范围：盐酸罗哌卡因一水合物细菌内毒素检测方法

责任人：细菌内毒素检验员、QC主管

内容：

1.实验材料及用具

1.1. 电子天平

1.2. 电热干燥箱

1.3. 恒温水浴箱

1.4.水银温度计

1.5. 旋涡混合器

1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号）

1.7.细菌内毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品)

1.8.细菌内毒素检查用水

1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。

2 实验准备

2.1. 玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容

器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入烤箱。

2.2. 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后，将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。达到规定时间后，关断电源，待烤箱温度自然降至室温。在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。

3.具体验证步骤

3.1. 鲎试剂灵敏度复核

3.1.1. 实验操作

3.1.1.1.细菌内毒素标准溶液的制备

取细菌内毒素工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内。

按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试对的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30 秒钟。

3.1.1.2.待复核鲎试剂的准备

取规格为0.1ml/ 支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入

瓶内。每支加入0.1ml 检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。

3.1.1.3.加样

将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4 支（管）4 列每列每支分别加入0.1ml 的2λ、λ、0.5λ、和0.25λ

的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。

3.1.1.

4.加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。

3.1.1.5. 观察并记录结果。将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出

缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）

3.1.2. 实验结果计算

如最大浓度2.0λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果（λc）。

λc = lg-1 (∑X/4)

式中x为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。

3.1.3结果判断

3.1.3.1.判断标准

当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰实验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。

3.1.3.2.判断结果：（记录附后）

3.2..干扰实验

3.2.1. 操作方法

3.2.1.1.目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。

3.2.1.2.制备内毒素标准对照溶液

取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、λ、0.5λ、0.25λ（方法同3.1.1.1.）。

3.2.2.3.制备含内毒素的供试品溶液

将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将3.2.3.1.中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。