化妆品皮肤致敏检测方法

化妆品皮肤致敏检测方法整理

化妆品引起的皮肤过敏可分为诱导接触、诱导阶段和激发接触三个阶段, 诱导接触是由于机体接触过敏原而诱导出致敏状态, 此时皮肤产生较轻的反应或无明显反应, 经过一段时间( 几周, 甚至几年) 的诱导期, 如果机体再次接触过敏原, 就会引起迟发性超敏感反应, 且在最初染毒部位以外的皮肤均可发生。

皮肤致敏可解分为5 个方面: ①化学物穿透进入皮肤; ②与内源性蛋白反应;

③皮肤代谢, 有的化学物, 称为前半抗原, 需要通过皮肤代谢进行活化成为半抗原之后才具备结合皮肤蛋白的能力。④树突细胞( D C ) 激活: 半抗原化的蛋白被未成熟的D C 细胞识别, 导致D C活化, 然后启动一系列的反应。激活后的D C 具有一些特性, 如上调细胞表面标志物(C D 83 或c D 86) , 分泌多种细胞因子( I L 一1β) , 下调参与抗原摄取的蛋白( 如水通道蛋白)。⑤抗原特异性免疫反应。

传统人体实验

单次斑贴试验: 受试者接受单次斑贴, 分别持续24、72 或96 h , 在诱发期间和去除斑贴后的10一14d, 用激发斑贴作用48 h 后, 对皮肤反应进行评分。通常在激发斑贴后, 需继续试用产品4w , 该试验仅能检测潜在的有效致敏剂,敏感性不足。

人体重复斑贴试验: 重复斑贴基本上与上述方法相同, 不同的是在1 0一

14d 的致敏诱导期间, 每隔2d 在同一部位连续给予受试物数次; 2 周后, 必须在另一位置的皮肤上再做一次斑贴测试。

人体最大化试验: 包括同一皮肤位置的5 次重复的4 h8 封闭式斑贴, 在去除和再施加斑贴之间有24 h 的休止期。刺激性物质的浓度是引起中等程度红斑的浓度, 对非刺激物质, 试验部位诱发前预先经5% 的S L S 斑贴2 h4 处理。最后一次诱发斑贴后, 休止2 周。在发生轻微刺激反应的皮肤部位经4 h8 封闭斑贴后进行评分,记录致敏指数。人体最大化试验可能对皮肤造成严重的后果, 操作起来有一定的风险。

通常认为, 已通过动物实验或其它有效的方法证实为致敏原的化妆品原料, 不应当再用志愿者进行测试。由于每次测试通常需要15 0一200 名志愿者参与, 不仅耗时,且非常昂贵, 尽管考虑使用人体最大化试验可能会减少志愿者数量,

但这种测试会增加某一反应的严重程度。而且人体志愿者个体反应差异较大,

为了获得95 % 置信区间, 仍然需要大量志愿者参与才能获得可靠结果。但基于伦理的考虑, 人体试验总是难以实现预期的效果。

体外代替方法动物实验

豚鼠最大值试验( Guinea, G PMT)使用福氏完全佐剂作为免疫增强剂, 试验

包括皮内注射、局部接触诱导和激发封闭斑贴三个过程。试验组至少10 只豚鼠, 对照组5 只, 诱导受试物浓度为能引起皮肤轻度刺激反应的最高浓度, 激发接触受试物浓度为不能引起皮肤刺激反应的最高浓度。第0 天( 诱导接触) , 将受试物皮内注射人豚鼠颈背部皮下, 第7d( 诱导接触) 将涂有受试物的封闭斑贴贴敷在同一注射部位去毛区固定4 8 h。2 周后第21d ( 激发接触),再将涂有受试物的斑贴贴敷在同一注射部位去毛区固定2h4。激发接触后, 除去受试物斑贴后24h、48h 和72h观察和比较实验组与对照动物的皮肤反应强度。

B ue hl er 封闭斑贴试验( B ue hler Test ,B T ) 不使用佐剂, 只在诱导期和激

发期局部皮肤上涂抹受试物。试验选用至少20 只豚鼠, 对照组至少10 只。受试物诱导浓度和激发浓度与G P M T 相同, 试验时直接将受试物斑贴涂在去毛皮肤上, 封闭贴敷6h。第7 天和16 天以同样方法重复一次。第28 天在豚鼠背部另一侧皮肤上涂抹受试物斑贴固定6h, 进行激发接触。激发接触后24 h和48h 观察皮肤红斑和水肿形成。由于没有使用F C A 免疫增强剂来刺激免疫系统,B T 的灵敏度比G P M T 低。

LLNA，(小鼠局部淋巴结实验):是鉴别皮肤变态反应的替代方法之一, 20 02 年被O E C D 正式采用为试验指南( T G 429 ), 同时也是被欧盟67 5/ 4 8 / EE c 认可的方法(B 42 )的方法。其原理是皮肤变态反应在诱导阶段即可引起接触部位局部淋巴结T 细胞的活化和增殖, 增殖反应与化学物的剂量( 即致敏原的致敏力) 成比例, 因此可以通过比较受试物与溶剂对照引起淋巴细胞增殖的剂量一反应关

系( 即刺激指数,SI ) 来评估增殖状况。当刺激指数≧3时, 提示受试物是潜在的皮肤致敏物。近年来又改进新方法，LLNA: Brd U-ELISA改良法。为掺入溴脱氧尿嘧啶核苷( Brd U) 和酶联免疫吸附测定( ELISA) 的LLNA方法对淋巴结重量、刺激指数( SI) 和EC 3值等致敏性指标进行分析，EC3值代表的是被测化学物质能够诱导出引流淋巴结中细胞增殖刺激阈值的必需浓度，试验同时应设赋形剂对照。同时还测量耳厚差和耳重刺激性指标，从而全面评价化学物的刺激性和致敏性。

基于法规限制和伦理方面的关怀，以及动物皮肤与人类皮肤的差异，人们做了很多工作努力寻找可以替代动物实验的方法预测化学物质的致敏性。

替代动物实验体外方法

对体内皮肤致敏发生过程的研究，目的在于开发模仿体内致敏过程的系统模型。从概念上讲，体外试验方法必须解决引起ACD(过敏性接触皮炎) 的关键步骤，这是非动物的替代试验方法应追寻的基本理论。由于人的LCs 比较稀缺并且容易自发激活，而DC 样细胞系，比如THP-1，U937 以及MUTZ-3，常用来替代人LCs 进行体外皮肤致敏性研究。这些细胞在接触致敏物后会产生类似于体内DCs 活化后的一些变化，比如，分子标记表达的升高，以及细胞因子的分泌。

Four alternative tests have so far been submitted to ECVAM（欧洲替代方法验证中心）prevalidation: (i) MUSST and (ii) h-Clat assess surface markers on dendritic cell lines, (iii) the direct peptide reactivity assay (DPRA) measures reactivity with model peptides and (iv) the

KeratinoSensTM assay which is based on detection of Nrf2-induced luciferase.

h-CLAT技术(人源细胞系激活)

人细胞系激活试验主要通过检测人THP-1 （人急性单核细胞白血病细胞株）细胞接触化学物后细胞表面标志物以及信号通路的变化判断其是否具有致敏性。

通过流式细胞仪检测PI( propidium iodide，碘化丙啶) 染色结果来评价测试样品的细胞毒性。根据PI 染色结果的数据，从中选取基于细胞活力75% ( cell viability，CV75 ) 剂量的8 个剂量组进行试验，样品处理细胞时间为24h。使用