微生物工程实验报告

实验1 培养基的配制和灭菌

一、目的要求

1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。

2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。

3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。

4.每2人一组，每人一份实验报告。

二、实验材料

1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH

2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。

3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。

三、实验内容

(一) 培养基的配制

1．培养基的配制方法和步骤

1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。

2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。

3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。

4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。

5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。

6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。

7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。

2．培养基的配制

A.富集培养基（液体）：

海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。

B. 2216E 斜面（固体）：

海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。

C. 无菌生理盐水和保种液：

生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。

每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。

保种液：生理盐水，加25%甘油

D. 碳源优化培养基：

以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。

(二) 分离培养微生物常用器皿的准备

1) 清洗一些玻璃仪仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿等。

2) 制作8层纱布，酒精棉。

3）Tip 头（0.2，1ml，分装枪头盒，牛皮纸包好，灭菌）；保种管；药勺；长竹签。

4）卫生（308 实验室超净台，实验台面）

(三) 培养基和玻璃器皿的灭菌方法

1、加压蒸汽灭菌法。其步骤如下：

1)灭菌锅内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。

2)接通电源，进行加热。

3)排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出冷空气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2 时再打开排气阀，待压力回复到将近零时，再关闭排气阀。

4)当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时,此时灭菌锅内的温度为121℃,维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。

5)灭菌时间一到，切断电源。待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌锅盖，取出物品。

2、紫外线灭菌

一般使用30W 灯管，9m3空间，距地面2m，打开紫外灯照射0.5h，可使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此上适用于空气表面杀菌。3、化学药剂消毒灭菌

微生物实验室中常用的化学杀菌剂有酒精、甲醛、高锰酸钾、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、来苏尔、过氧乙酸等，它们有的是杀菌剂，有的是抑制剂。

四、思考题

1.固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？

答：1）加热器功率不能太高，也不能太低。太高，容易沸腾和把培养基烧焦；太低，培养基容易凝固。

2）受热要均匀，可以垫上石棉网，要用玻璃棒不停缓慢搅拌。

3）加热完毕后，要在合适的温度（60℃左右）倒平板，防止凝固。

2.培养基中加琼脂的作用是什么？

答：充当固化剂，起支持作用

3.如何检查培养基灭菌是否彻底？

答：把灭菌后的培养基，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果培养基出现了杂菌菌落，说明灭菌不彻底；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。

经过几次检验都证明已彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。

实验二产碱性蛋白酶海洋细菌的分离筛选

一、目的和要求

根据一定的实验目的如酶类的生产，建立合适、精确的筛选模型，并从特定的样品如海泥中筛选出高产菌株。

目的：加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。

二、仪器与试剂

1. 仪器设备：灭菌锅，培养箱，摇床，玻璃仪器（每组需用量）（已准备）

2. 需准备的培养基

A.富集培养基（液体）：

海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，陈海水1L，pH7.6。取50mL 分装250mL 三角瓶后，8层纱布封口，外包1层牛皮纸，115℃高温灭菌30min。

B. 2216E 斜面（固体）：

海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内加入5mL，115℃高温灭菌30min，灭菌后摆斜面。

C. 无菌生理盐水：

NaCl 0.85% 去离子水配制。每支试管加入4.5mL，盖上试管帽、包扎、115℃高温灭菌30min。

D. 碱性蛋白酶筛选培养基：海水2216E-脱脂奶粉平板：A：4%脱脂奶