第十四章 单克隆抗体_PPT幻灯片
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单克隆抗体PPT课件
单克隆抗体的应用领域
01
02
03
04
基础研究
用于研究生物分子结构和功能 ，探索生命现象的本质。
诊断
用于检测生物样本中的抗原、 抗体、激素等生物分子，用于
疾病的诊断和监测。
治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾 病、感染性疾病等，通过与靶 分子结合，发挥治疗作用。
免疫学检测
用于检测食品、环境、生物武 器等中的有害物质和病原微生
高特异性
总结词
单克隆抗体具有极高的特异性，能够精确地识别和结合特定的抗原，几乎不会 与其它物质发生交叉反应。
详细描述
单克隆抗体的特异性表现在它能够精确地识别和结合细胞、蛋白质、病毒等抗 原的特定表位，这种结合具有高度的选择性，避免了与其他物质的交叉反应， 提高了检测和治疗的准确性。
高灵敏度
总结词
单克隆抗体可以用于鉴别血型、 检测血红蛋白病和白细胞表面抗 原，有助于血液疾病的诊断和治 疗。
生物标记与示踪研究
1 2
细胞分型
利用单克隆抗体标记不同细胞表面抗原，对细胞 进行分型和鉴定，有助于研究细胞发育、分化及 功能。
示踪研究
将单克隆抗体与荧光、放射性同位素等标记物结 合，追踪生物体内的物质分布、代谢和排泄过程。
良好的重复性
总结词
单克隆抗体的生产和制备具有高度的一致性和重复性，保证了产品质量和实验结果的可靠性。
详细描述
通过采用适当的细胞培养技术，可以在实验室条件下实现单克隆抗体的规模化生产和制备。由于单克 隆抗体的克隆来源单一，其生产和制备过程具有高度的一致性和重复性，这使得单克隆抗体的质量稳 定可靠，实验结果的可重复性强。
提高单克隆抗体的生产效率与质量
优化细胞培养条件
《单克隆抗体技术》课件
单克隆抗体的制备与纯化
单克隆抗体是通过杂交瘤细胞在体外培养或注射到动物体内进行体内培养产生的，经过一系列的分离 和纯化过程，最终获得高纯度、高特异性的单克隆抗体。
制备过程中通常采用各种层析技术、沉淀技术等对抗体进行分离和纯化，以确保获得高质量的单克隆 抗体。
单克隆抗体的鉴定与质量控制
鉴定是通过对单克隆抗体的免疫学特 性、生物学活性和分子结构等方面进 行检测和评估，以确定其特异性和质 量。
总结实验过程和结果，分析存在的问题和改 进方向，为后续实验提供参考和依据。
感谢您的观看
THANKS
生物标记物
用于研究细胞生物学、分子生物学 等领域。
03
02
生物药物
用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等 。
免疫分析
用于检测生物样品中的抗原、抗体 等。
04
02 单克隆抗体技术的原理
杂交瘤细胞系的建立
杂交瘤细胞系的建立是单克隆抗体技 术的核心步骤之一，通过将免疫脾细 胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细 胞。
通过抗原-抗体反应检测杂交瘤细胞产生的 抗体特异性。
克隆筛选
通过选择性培养基筛选出能够产生所需抗体 的杂交瘤细胞克隆。
细胞培养与抗体纯化
将筛选出的杂交瘤细胞进行培养，并采用蛋 白质纯化技术获得单克隆抗体。
实验结果分析与总结
结果分析
对实验结果进行统计分析，评估杂交瘤细胞 的抗体产生能力和特异性。
总结
这些杂交瘤细胞既具有脾细胞无限增 殖的能力，又具有产生特异性抗体的 能力，从而为单克隆抗体的制备提供 了稳定的细胞源。
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
在筛选过程中，通过抗原-抗体反应检 测杂交瘤细胞产生的抗体，筛选出能 够产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞 。
《单克隆抗体》课件
05
单克隆抗体的未来发展
新型单克隆抗体的研发
总结词
随着生物技术的不断发展，新型单克 隆抗体的研发将更加活跃，以满足更 多治疗需求。
详细描述
新型单克隆抗体将通过基因工程技术 、蛋白质工程技术等手段进行设计和 优化，以改善其疗效、降低副作用和 降低生产成本。
单克隆抗体与其他技术的结合应用
总结词
单克隆抗体将与其他治疗手段和技术相结合，以实现更有效的疾病治疗和诊断 。
03
类型
IgG、IgM、IgA等。
单克隆抗体的发现和发展历程
1901年
Ehrlich提出“侧链学说”，认为抗体是 由细胞产生的化学物质。
1986年
FDA批准第一个单克隆抗体药物上市， 用于治疗非霍奇金淋巴瘤。
1975年
Kohler和Milstein首次成功制备出单克隆 抗体。
2014年
FDA批准第一个全人源单克隆抗体药物 上市，用于治疗类风湿性关节炎。
生物治疗
总结词
单克隆抗体在生物治疗中具有显著疗效 ，可用于治疗癌症、自身免疫病等多种 疾病。
VS
详细描述
通过靶向肿瘤细胞表面抗原或免疫系统中 的特定分子，单克隆抗体能够发挥抗癌作 用。例如，针对某些癌症的单克隆抗体药 物能够抑制肿瘤生长、扩散和转移，提高 患者生存率和生活质量。此外，在自身免 疫病治疗中，单克隆抗体也具有良好疗效 ，能够调节免疫系统，缓解单克隆抗体的概述 • 单克隆抗体的制备 • 单克隆抗体的特性 • 单克隆抗体的应用实例 • 单克隆抗体的未来发展
01
单克隆抗体的概述
单克隆抗体的定义
01
单克隆抗体
由单一B细胞克隆产生的具有 高度特异性识别抗原表位的抗
(培训课件)单克隆抗体PPT幻灯片
• 种类：氢氧化铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多 糖、细胞因子、明矾等，其中弗氏不完全佐 剂（羊毛脂：石蜡油=1:5）和弗氏完全佐剂 （弗氏不完全佐剂＋灭活的分枝结核杆菌） 是目前动物实验中最常用佐剂。
4
• 抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的 B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。
5
6
脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes)
淀）。
18
（2）HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
19
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则
①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时； ②缺乏HGPRT酶和TK酶； ③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高；
脾细胞的选择
由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Bal b/c小鼠，因此应尽 量选择同源的Bal b/c健康小鼠（8-12周）作为免疫动物。
死亡
20
3、阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）
• 检测时间：杂交瘤细胞布满孔底1／10时开 始检测特异性抗体，进行筛选。
• 检测方法：最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法
3）离心，弃上清，加15mL HAT培养基，混匀，转入96孔 板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100 ul。
4
• 抗体：机体免疫细胞被激活后，由分化成熟的 B淋巴细胞-浆细胞合成、分泌的免疫球蛋白。
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6
脾脏与B淋巴细胞(B lymphocytes)
淀）。
18
（2）HAT培养基的筛选
融合后细胞混合液
HAT培养基
2 weeks later
HT培养基
1 week later
正常培养基
19
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
骨髓瘤细胞 (myeloma cells)的选择原则
①克隆效应高，能在体外连续生长，倍增期短于24小时； ②缺乏HGPRT酶和TK酶； ③本身不合成Ig，且不抑制杂交瘤细胞中的Ig合成基因。 ④与小鼠淋巴细胞融合率相当高；
脾细胞的选择
由于目前常用的骨髓瘤细胞普遍来自Bal b/c小鼠，因此应尽 量选择同源的Bal b/c健康小鼠（8-12周）作为免疫动物。
死亡
20
3、阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）
• 检测时间：杂交瘤细胞布满孔底1／10时开 始检测特异性抗体，进行筛选。
• 检测方法：最常用酶联免疫吸附法(ELISA) 间接免疫荧光法(IFA) 放射免疫法(RIA) 双相扩散法
3）离心，弃上清，加15mL HAT培养基，混匀，转入96孔 板（预先有HAT培养基培养的饲养细胞），每孔100 ul。
单克隆抗体技术医学PPT
可溶性抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于 5000 Da 物质。
注意：可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗 原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。
2、免疫动物
• （1）动物选择：一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品 系的动物进行免疫（如：小鼠）。由于免疫动物品系与所 采用的骨髓瘤细胞差异较远，产生的杂交瘤细胞稳定性越 差。
（2）融合技术 一种是加入融合剂后直接离心使两种细胞紧密接触
（R<3000r/min），另一种是加入融合剂后轻轻搅动融 合。
• （3）提高融合频率的可能途径
•
融合过程中由于细胞特性、操作过程、PEG毒性等
多种因素都可能影响融合而减少融合频率。
•
方法：对亲本细胞预处理，改进融合技术，加入饲养
层细胞促进杂交瘤生长。
（1）体外制备
• 体外使用旋转培养瓶大量培养杂交瘤细胞，从上清 中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为 10～60μg／ ml。如果大量生产，费用较高。
• 随着大规模的生产，需大量血清而使成本增加，同 时血清会影响单抗的纯度，大量血清的存在干扰抗体活性。 1978年iscove用补充大豆类脂，牛血清蛋白，转铁蛋白等 添加成分的无血清培养基培养杂交瘤细胞成功。
• HAT选择性培养基： 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤
Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。
单克隆抗体制备原理
• HAT培养基的选择原理：
• （1）氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途 径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正 常途径合成DNA。
3. 骨髓瘤细胞的准备
• 细胞株处于良好的生长状态，本身不能分泌任何抗体或免疫 球蛋白； • 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者组 织相容性抗原一致； • 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。
注意：可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗 原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。
2、免疫动物
• （1）动物选择：一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品 系的动物进行免疫（如：小鼠）。由于免疫动物品系与所 采用的骨髓瘤细胞差异较远，产生的杂交瘤细胞稳定性越 差。
（2）融合技术 一种是加入融合剂后直接离心使两种细胞紧密接触
（R<3000r/min），另一种是加入融合剂后轻轻搅动融 合。
• （3）提高融合频率的可能途径
•
融合过程中由于细胞特性、操作过程、PEG毒性等
多种因素都可能影响融合而减少融合频率。
•
方法：对亲本细胞预处理，改进融合技术，加入饲养
层细胞促进杂交瘤生长。
（1）体外制备
• 体外使用旋转培养瓶大量培养杂交瘤细胞，从上清 中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为 10～60μg／ ml。如果大量生产，费用较高。
• 随着大规模的生产，需大量血清而使成本增加，同 时血清会影响单抗的纯度，大量血清的存在干扰抗体活性。 1978年iscove用补充大豆类脂，牛血清蛋白，转铁蛋白等 添加成分的无血清培养基培养杂交瘤细胞成功。
• HAT选择性培养基： 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤
Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。
单克隆抗体制备原理
• HAT培养基的选择原理：
• （1）氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途 径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正 常途径合成DNA。
3. 骨髓瘤细胞的准备
• 细胞株处于良好的生长状态，本身不能分泌任何抗体或免疫 球蛋白； • 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者组 织相容性抗原一致； • 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。
克隆抗体技术及其应用幻灯片PPT
➢由杂交瘤细胞系产生的，针 对同一抗原决定簇的抗体— —高度均质。
➢由同一个B细胞克隆产生的 同异质的抗体组成，是针对 抗原的单一决定簇抗体。
➢单抗纯度高，专一性强、重 复性好。无披次差异。
➢易于标准化。
➢能保证无限量供应。
免疫血清
又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
➢无法在HAT选择培养剂中生长
➢能无限地快速增殖 ➢既不合成轻链又不合成重链
HAT
小鼠脾细胞 （B-Cell ）：
✓合成和分泌特异性抗体 ✓无法进行体外长期培养
脾细胞－SP2/O融合细胞：
➢HGPRT＋，能在HAT选择培养剂中生长 ➢能无限地快速增殖 ➢合成和分泌特异性抗体
Fish Disease Research Center
克隆抗体技术及其应用幻 灯片PPT
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Hale Waihona Puke Fish Disease Research Center
Fish Disease Research Center
Fish Disease Research Center
单克隆技术的原理
骨髓瘤细胞 （SP2/O-Ag14 ）：
➢丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转 移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase， HGPRT－）
蛋白质等生物活性分子的纯化； 细胞生物学——组织定位； 分子病毒学——结构分析； 特定生物分子的功能研究；
➢由同一个B细胞克隆产生的 同异质的抗体组成，是针对 抗原的单一决定簇抗体。
➢单抗纯度高，专一性强、重 复性好。无披次差异。
➢易于标准化。
➢能保证无限量供应。
免疫血清
又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
➢无法在HAT选择培养剂中生长
➢能无限地快速增殖 ➢既不合成轻链又不合成重链
HAT
小鼠脾细胞 （B-Cell ）：
✓合成和分泌特异性抗体 ✓无法进行体外长期培养
脾细胞－SP2/O融合细胞：
➢HGPRT＋，能在HAT选择培养剂中生长 ➢能无限地快速增殖 ➢合成和分泌特异性抗体
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单克隆技术的原理
骨髓瘤细胞 （SP2/O-Ag14 ）：
➢丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转 移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase， HGPRT－）
蛋白质等生物活性分子的纯化； 细胞生物学——组织定位； 分子病毒学——结构分析； 特定生物分子的功能研究；
单克隆抗体(用)PPT
培养
顾
！
17
机
会
只
对
进
取
有
为
的
人
,
开 放
注射到小鼠体内
体外培养
庸
人
永
远
无
法 光
单克隆抗体
顾 由单个杂交瘤细胞通过克隆，所产生的化学性质
！ 单一、特异性强的抗体。
18
活动三、用以下文字和箭头来 构建单克隆抗体的制备过程
已免疫的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、BB 细胞，B瘤细胞，瘤瘤细胞、杂交瘤 细胞、产生专一抗体的杂交瘤细胞、 体外培养、体内培养、单克隆抗体、 融合、筛选
产生抗体的B淋巴细胞， 4.如果一个农夫被毒蛇
下文将其简称为B淋巴细 咬了，如何获得相应的
胞
抗体来治疗？
抗体：能够与抗原发生特
异性结合的免疫球蛋白。
能产生抗体的细胞是浆 细胞（即效应B细胞）。10
抗体的传统生产方法
抗原 反复注射
该法制备抗体的缺点：
产量低、纯度低，且 抗体的特异性差、灵 敏度低。
从动物的血清中分离抗体
诊断试剂——最广泛应用
准确、高效、简易、快速
21
治疗疾病和运载药物
主要用于治疗癌症治疗，单克隆抗体作为载体，运载抗 癌药物，形成“生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。
“生物导弹” ＝单克隆抗体＋药物 单抗导向，药物为弹头
22
两个过程 动物细胞培养过程 单克隆抗体制备过程
一个诱导细胞融合的新方法
－－灭活的病毒 三个“一” 一个新细胞－－杂交瘤细胞
14
机
会 只
用抗原免疫小鼠
骨髓瘤细胞的培养
对
进Байду номын сангаас
高中生物单克隆抗体制备(共38张PPT)
2、它相当于植物体细胞杂交过 程的哪一步？ 3、它们的过程、基本原理、诱 导融合方法和意义是否相同？
1.1动物细胞融合的概念
鼠B淋巴细胞 鼠骨髓瘤细胞
人工诱导
动物细胞融合（细胞杂交）
是指（在一定的条件下）两
个或多个细胞结合形成一个
细胞（该单核细胞称为杂交
细胞）的过程。
杂交瘤细胞
问题：1、它相当于植物体细胞杂交过 程的哪一步？ 2、它们的过程、基本原理、诱 导融合方法和意义是否相同？
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
3.若细胞两两融合后， 有几种融合情况？
选择性培养基 筛选1 克隆化
多种杂 交细胞
抗原-抗体 杂交法
筛选2（有限稀释）
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
4.第一次筛选出的杂交瘤
细胞为何需进行克隆化培
选择性培养基 筛选1
养和专一抗体检测？
多种杂
（ 特异性强、灵敏度高，可大量制备）
（4）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的 迅速（ 大量增殖 ）特点，又具备淋巴细胞 的（ 分泌专一抗体）特点，经过选择性培养 的杂交瘤细胞，还需进行（ 克隆化培养 ） 和（ 抗体检测 ），经多次筛选，就可获得足
够数量的能分泌所需抗体的细胞。最后将杂 交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或小 鼠腹腔内增殖，从（ 细胞培养液 ）或 （ 小鼠的腹水 ）中，就可以提取出大量 的单克隆抗体了。
一个效应bb细胞只分泌一种特异性抗体杂交瘤细胞动物细胞培养技术44单克隆抗体的制备方案动物细胞融合技术单克隆抗体既能产生特异性抗体又能大量繁殖的细胞一个骨髓瘤细胞能无限增殖制备单克隆抗体1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验5单克隆抗体制备过程步骤注射抗原效应bb细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基筛选11抗原抗体杂交法克隆化单克隆抗体筛选22有限稀释1
1.1动物细胞融合的概念
鼠B淋巴细胞 鼠骨髓瘤细胞
人工诱导
动物细胞融合（细胞杂交）
是指（在一定的条件下）两
个或多个细胞结合形成一个
细胞（该单核细胞称为杂交
细胞）的过程。
杂交瘤细胞
问题：1、它相当于植物体细胞杂交过 程的哪一步？ 2、它们的过程、基本原理、诱 导融合方法和意义是否相同？
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
3.若细胞两两融合后， 有几种融合情况？
选择性培养基 筛选1 克隆化
多种杂 交细胞
抗原-抗体 杂交法
筛选2（有限稀释）
单克隆 抗体
注射抗原
效应B细胞
骨髓瘤细胞
融合
4.第一次筛选出的杂交瘤
细胞为何需进行克隆化培
选择性培养基 筛选1
养和专一抗体检测？
多种杂
（ 特异性强、灵敏度高，可大量制备）
（4）选出的杂交瘤细胞既具备骨髓瘤细胞的 迅速（ 大量增殖 ）特点，又具备淋巴细胞 的（ 分泌专一抗体）特点，经过选择性培养 的杂交瘤细胞，还需进行（ 克隆化培养 ） 和（ 抗体检测 ），经多次筛选，就可获得足
够数量的能分泌所需抗体的细胞。最后将杂 交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或小 鼠腹腔内增殖，从（ 细胞培养液 ）或 （ 小鼠的腹水 ）中，就可以提取出大量 的单克隆抗体了。
一个效应bb细胞只分泌一种特异性抗体杂交瘤细胞动物细胞培养技术44单克隆抗体的制备方案动物细胞融合技术单克隆抗体既能产生特异性抗体又能大量繁殖的细胞一个骨髓瘤细胞能无限增殖制备单克隆抗体1975年英国科学家米尔斯坦和柯勒的实验5单克隆抗体制备过程步骤注射抗原效应bb细胞骨髓瘤细胞融合多种杂交细胞选择性培养基筛选11抗原抗体杂交法克隆化单克隆抗体筛选22有限稀释1
单克隆抗体概述ppt课件
2015年全球最畅销药物TOP 10中有5个单抗，分别是阿达木单抗、 英夫利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗和曲妥珠单抗，它们占 据了单抗药物的半壁江山，销售额约为426.6亿美元，约占2015 年全球单克隆抗体药物总销售额的44%。
根据预测，2016-2020 年，全球单抗产业仍将以9.84%的RAGR快 速发展（同期全球药品市场CAGR约为 5%），2020年市场规模有 望突破1300亿美元。
体外法
体外法(杂交瘤细胞体外培养法)的产品纯度高,可以避免鼠类病毒的
污染,简化质检项目,操作具有可控制性,适用于大规模工业生产,因此
是人用鼠源单抗生产方式的主要发展方向。体外法的制备流程也基
Hale Waihona Puke 本相同，即从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠获取脾细胞，选育
出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞，待细胞融合后，对单个
.
8
嵌合抗体三种应用形式
嵌合免疫球蛋白G 嵌合Fab和嵌合 F（ab’）2
.
9
人源化单克隆抗体
完全CDR移植抗体
部分CDR移植抗体
特异决定区移植抗体
.
10
完全CDR移植抗体
完全CDR移植抗体由于鼠源性抗体VR中的骨架区仍残留一 定的免疫原性，为最大限度的减少鼠源成分，用人FR替代鼠 FR可形成更为完全的人源化抗体，即在此抗体中除了３个CDR 是鼠源以外，其余全部是人源结构，这一类型的抗体称为CDR 移植抗体或改型抗体。应用这一策略，将鼠源McAb的CDR区 完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗体。但随
.
11
部分CDR移植抗体
在简单CDR移植的基础上又相继发展了部分CDR移植技术。 研究发现轻链的 CDR1、CDR2和重链的CDR3对保证抗体与抗原 特异性结合至关重要，其余三个CDR的作用则较低。因此只将 抗体结合抗原必须的CDR移植到人抗体的FR骨架上即能获得对 人免疫原性更小的嵌合抗体，这类抗体称为部分CDR移植抗体。
根据预测，2016-2020 年，全球单抗产业仍将以9.84%的RAGR快 速发展（同期全球药品市场CAGR约为 5%），2020年市场规模有 望突破1300亿美元。
体外法
体外法(杂交瘤细胞体外培养法)的产品纯度高,可以避免鼠类病毒的
污染,简化质检项目,操作具有可控制性,适用于大规模工业生产,因此
是人用鼠源单抗生产方式的主要发展方向。体外法的制备流程也基
Hale Waihona Puke 本相同，即从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠获取脾细胞，选育
出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞，待细胞融合后，对单个
.
8
嵌合抗体三种应用形式
嵌合免疫球蛋白G 嵌合Fab和嵌合 F（ab’）2
.
9
人源化单克隆抗体
完全CDR移植抗体
部分CDR移植抗体
特异决定区移植抗体
.
10
完全CDR移植抗体
完全CDR移植抗体由于鼠源性抗体VR中的骨架区仍残留一 定的免疫原性，为最大限度的减少鼠源成分，用人FR替代鼠 FR可形成更为完全的人源化抗体，即在此抗体中除了３个CDR 是鼠源以外，其余全部是人源结构，这一类型的抗体称为CDR 移植抗体或改型抗体。应用这一策略，将鼠源McAb的CDR区 完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗体。但随
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11
部分CDR移植抗体
在简单CDR移植的基础上又相继发展了部分CDR移植技术。 研究发现轻链的 CDR1、CDR2和重链的CDR3对保证抗体与抗原 特异性结合至关重要，其余三个CDR的作用则较低。因此只将 抗体结合抗原必须的CDR移植到人抗体的FR骨架上即能获得对 人免疫原性更小的嵌合抗体，这类抗体称为部分CDR移植抗体。
单克隆抗体制备(共44张PPT)
单克隆抗体制备流程图
亲本细胞的选择与制备
骨髓瘤细胞 (NS-1)
骨髓瘤细胞需定期用
细胞株稳定，易传代培养；
细胞株本身不产生Ig
是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖 转换酶 缺陷株
(hypoxanthine-guanine phos phoribosyl transferase ,HGPRT)
最常用的骨髓瘤细胞是NS-1 和SP2/0细胞株
PEG可导致细胞膜上 脂类物质的物理结构 重排，使细胞膜容易 打开而有助于细胞融 合。
常见的几种融合形式
细胞DNA合成途经
HAT选择培养基
三种关键成分：
次黄嘌呤（hypoxanthine,H）
氨基蝶呤（aminopterin,A）
胸腺嘧啶（thymidine ，T）
◆是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的 生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞
因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，分别针对这些不同的eptope。
每 mL 含有100 个 但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍采用传统方法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应是最可靠的。
单克隆抗体的制备流程和应用
细胞，若只要取一个 试采血 确定有抗体产生后，即可取出 脾脏以收集脾脏细胞(大多为B 细胞) 与骨髓瘤细胞进行 细胞融合。
2)体外增量培养法： 把杂交瘤细胞在大型培养槽 中培养，收集培养液上清即得抗体，但每 mL 只得 约数 mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细 胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极 为昂贵 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。
单克隆抗体的性质鉴定
种抗体；因此在传统抗血清中， 都含有许多种不同的抗体，分
人源化单克隆抗体PPT课件
解决方案
灵长目源抗体也是 一类嵌合抗体，通过免 疫短尾猿猴产生。由于 其抗体的可变区与人可 变区无差异，不至于发 生抗体反应。
鼠源抗体
嵌合抗体
2024/1/27
2.CDR移植抗体（CDR grafted antibody)
真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区 （CDR）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可 达到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。
核糖体展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行， 用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，且能够增加表达的蛋白质的溶 解度。
2024/1/27
4.2.转基因小鼠
通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导 入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小 鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人DNA片段具有完善 的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任 何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力 的人抗体。 案例：
人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。
4.4.其他方法
XTL生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法， 用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该公 司已用此法生产出一种全人单抗。
人源化抗体的临床应用
• 近年来 ,人源化抗体和人抗体的出现为临床应 用带来了新的希望 ,当前正处于临床研究的多 种抗体中 , 嵌合抗体和 人 源 化 抗 体 所 占 比 例 大 于70 %。目前的人源化抗体 ,主要用于肿 瘤、 自身免疫性疾病和心血管疾病的治疗以 及抗移植排斥反应和抗病毒感染等方面。
(2) 鼠源性单抗在人体内生物活性降低力于人源性抗体的研究。
人源化治疗性单克隆抗体的研究进展
构建的基本思路
鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体内的抗体 分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避 免诱导HAMA（人抗鼠抗体）反应。
灵长目源抗体也是 一类嵌合抗体，通过免 疫短尾猿猴产生。由于 其抗体的可变区与人可 变区无差异，不至于发 生抗体反应。
鼠源抗体
嵌合抗体
2024/1/27
2.CDR移植抗体（CDR grafted antibody)
真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区 （CDR）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可 达到95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。
核糖体展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行， 用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，且能够增加表达的蛋白质的溶 解度。
2024/1/27
4.2.转基因小鼠
通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导 入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小 鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人DNA片段具有完善 的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任 何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力 的人抗体。 案例：
人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。
4.4.其他方法
XTL生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法， 用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该公 司已用此法生产出一种全人单抗。
人源化抗体的临床应用
• 近年来 ,人源化抗体和人抗体的出现为临床应 用带来了新的希望 ,当前正处于临床研究的多 种抗体中 , 嵌合抗体和 人 源 化 抗 体 所 占 比 例 大 于70 %。目前的人源化抗体 ,主要用于肿 瘤、 自身免疫性疾病和心血管疾病的治疗以 及抗移植排斥反应和抗病毒感染等方面。
(2) 鼠源性单抗在人体内生物活性降低力于人源性抗体的研究。
人源化治疗性单克隆抗体的研究进展
构建的基本思路
鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体内的抗体 分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避 免诱导HAMA（人抗鼠抗体）反应。
《单克隆抗体应用》课件
单克隆抗体的特性
总结词
单克隆抗体具有高度特异性、一致性和稳定性。
详细描述
由于单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的，因此它具有高度特异性，能够与特 定的抗原结合。此外，由于单克隆抗体的生产过程是高度控制的，因此其质量和 性能具有一致性和稳定性。
02
单克隆抗体的应用领域
生物医学研究
抗体标记技术
利用单克隆抗体与特定抗原的结 合特性，对生物样本中的抗原进 行标记，用于检测、定位和追踪 抗原的表达和分布。
利用单克隆抗体标记的免疫细胞对肿瘤进行攻击，提高肿瘤治疗的疗效和患者的生存率。
03
单克隆抗体的研究进展
新药研发
肿瘤免疫治疗
利用单克隆抗体作为肿瘤免疫治 疗的靶点，通过激活免疫系统来 攻击肿瘤细胞。
自身免疫性疾病治
疗
针对自身免疫性疾病，如类风湿 性关节炎、红斑狼疮等，单克隆 抗体可以抑制免疫反应，缓解症 状。
《单克隆抗体应用》ppt课件
CONTENTS
• 单克隆抗体的基础知识 • 单克隆抗体的应用领域 • 单克隆抗体的研究进展 • 单克隆抗体的挑战与前景 • 单克隆抗体的未来展望
01
单克隆抗体的基础知识
单克隆抗体的定义
总结词
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的具有高度特异性的免疫球蛋白。
详细描述
单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生的，这种细胞是由免疫的B细胞和骨髓瘤细胞融 合而成。这种杂交瘤细胞能够大量繁殖，并且只产生一种类型的抗体。
免疫疗法
单克隆抗体可以与免疫疗法结合，通过调节免疫 反应来增强抗肿瘤效果。
基因治疗
通过将基因导入单克隆抗体，可以实现更精确的 靶向治ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，提高治疗效果并降低副作用。
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发明单克隆抗体技术
Nobel Prize in 1984
抗体发展的三个阶段
多克隆抗血清 单克隆抗体 基因工程抗体
抗原 免疫
传统抗血清
所有抗体混合
31 2 4
BA LB /c
1234
脾脏 淋巴結 B 細胞
31 2 4
抗体药物销售趋势图
抗体 是对其抗原有极强专一性 的 魔弹 或 巡弋飞弹
研究 医疗 检验
抗体治疗疾病的机制
抗原失活
免疫效应细胞 吞噬
抗原表面弱化 易受补体破坏
单抗研发的演变历程
鼠单抗 100% 鼠源 OKT-3 Panorex Zevalin
鼠/人嵌合单抗 (66-75 % 人源) ReoPro, Rituxan Remicade Simulect
人源化单抗
(90-95 % 人源)
Zenapax, Mylotarg, Herceptin, Campath100%
人源
Synagis
抗体攻击病毒
凝 集 细 菌
抗 SARS 的单抗 SARS-CoV
Epitope, Antigenic determinant
抗原決定基
● 一个抗原分子上可能有数个抗原決定基 ● 每個 抗原決定基 至少誘生一種專一性抗体
癌细胞 可培养生长
浆细胞 B cell 可分泌抗体 一個 B cell 只 产生一种抗体
YY Y
Y YY
YYY
YY YY Y
YY YY
细
胞
融合瘤
融
合
Hybridoma
两组染色体混在一起
也可以培养生長 产生专一性抗体
1 3
2 4
m m
m m
1 23
4
12 34
取出脾細胞
+ 癌細胞
细胞融合
单抗
各抗体分开
● 蛋白质性 抗原決定基 含有六个以上氨基酸
1 多克隆抗血清
白蛋白
球蛋白
a1 a2
b
（a）
（b）
（c）
对健康人用疫苗进行主动 免疫，免疫前（a）和免 疫后10天 （b）分别采血 并对血清蛋白进行凝胶电 泳分析。免疫前血清中的 g 球蛋白条带较宽，免疫 之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失（c）。
人源化抗体又称CDR移植抗 体
CDR序列
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
图4 鼠单克隆V区人源化（CDR移植）
以免疫转印法检测 特定抗原 以毒素连结抗体攻击 病变細胞 以 ELISA 侦测特定 病原体
SDA批准进入临床的治疗用单抗
•抗T细胞免疫毒素 •抗C-ALL免疫毒素 •131I-抗肝癌单克隆抗体 •抗人CD25单克隆抗体 •抗乙脑单克隆抗体 •抗流行性出血热抗体 •抗人CD3单克隆抗体 •抗人IL-8单克隆抗体
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
共转染细胞
人改型抗体（CDR移植）
定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V） 中互补决定簇（CDR）序列改换成抗体 亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”， 因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移 植抗体 意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗
(3) 鼠单抗人源化
将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在 小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术， 产生大量完全人源化抗体
●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体
●可变区人源化——人改型抗体
●用抗体库技术进行人源化
鼠单抗人源化
人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略
启动子
Pr 鼠VH 人 CH
Pr 鼠VL 人 CL
NS稀释至 2～5%
绵羊红细胞的制备流程图
摇动 1520min
周可
4℃
保
存
3
NS洗涤3 次 2000r/mi n
10min
取适量
100℃水浴 2～2.5h 杀菌
无菌试验
液体培养或 斜面培养 37℃24h
细菌细胞抗原的制备流程图
O菌体抗原
杂交瘤技术过程
可生产有用抗体的 淋巴細胞 若与 癌细胞融合，则形成稳定而可培 养的细胞株。
Nobel Prize in 1984
抗体发展的三个阶段
多克隆抗血清 单克隆抗体 基因工程抗体
抗原 免疫
传统抗血清
所有抗体混合
31 2 4
BA LB /c
1234
脾脏 淋巴結 B 細胞
31 2 4
抗体药物销售趋势图
抗体 是对其抗原有极强专一性 的 魔弹 或 巡弋飞弹
研究 医疗 检验
抗体治疗疾病的机制
抗原失活
免疫效应细胞 吞噬
抗原表面弱化 易受补体破坏
单抗研发的演变历程
鼠单抗 100% 鼠源 OKT-3 Panorex Zevalin
鼠/人嵌合单抗 (66-75 % 人源) ReoPro, Rituxan Remicade Simulect
人源化单抗
(90-95 % 人源)
Zenapax, Mylotarg, Herceptin, Campath100%
人源
Synagis
抗体攻击病毒
凝 集 细 菌
抗 SARS 的单抗 SARS-CoV
Epitope, Antigenic determinant
抗原決定基
● 一个抗原分子上可能有数个抗原決定基 ● 每個 抗原決定基 至少誘生一種專一性抗体
癌细胞 可培养生长
浆细胞 B cell 可分泌抗体 一個 B cell 只 产生一种抗体
YY Y
Y YY
YYY
YY YY Y
YY YY
细
胞
融合瘤
融
合
Hybridoma
两组染色体混在一起
也可以培养生長 产生专一性抗体
1 3
2 4
m m
m m
1 23
4
12 34
取出脾細胞
+ 癌細胞
细胞融合
单抗
各抗体分开
● 蛋白质性 抗原決定基 含有六个以上氨基酸
1 多克隆抗血清
白蛋白
球蛋白
a1 a2
b
（a）
（b）
（c）
对健康人用疫苗进行主动 免疫，免疫前（a）和免 疫后10天 （b）分别采血 并对血清蛋白进行凝胶电 泳分析。免疫前血清中的 g 球蛋白条带较宽，免疫 之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失（c）。
人源化抗体又称CDR移植抗 体
CDR序列
CDR序列
鼠单克隆抗体
人抗体
人源化抗体
图4 鼠单克隆V区人源化（CDR移植）
以免疫转印法检测 特定抗原 以毒素连结抗体攻击 病变細胞 以 ELISA 侦测特定 病原体
SDA批准进入临床的治疗用单抗
•抗T细胞免疫毒素 •抗C-ALL免疫毒素 •131I-抗肝癌单克隆抗体 •抗人CD25单克隆抗体 •抗乙脑单克隆抗体 •抗流行性出血热抗体 •抗人CD3单克隆抗体 •抗人IL-8单克隆抗体
免疫球蛋白 基因载体的构建
H链嵌合载体
L 链嵌合载体
共转染细胞
人改型抗体（CDR移植）
定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V） 中互补决定簇（CDR）序列改换成抗体 亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”， 因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移 植抗体 意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗
(3) 鼠单抗人源化
将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在 小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术， 产生大量完全人源化抗体
●恒定区人源化——人-鼠嵌合抗体
●可变区人源化——人改型抗体
●用抗体库技术进行人源化
鼠单抗人源化
人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略
启动子
Pr 鼠VH 人 CH
Pr 鼠VL 人 CL
NS稀释至 2～5%
绵羊红细胞的制备流程图
摇动 1520min
周可
4℃
保
存
3
NS洗涤3 次 2000r/mi n
10min
取适量
100℃水浴 2～2.5h 杀菌
无菌试验
液体培养或 斜面培养 37℃24h
细菌细胞抗原的制备流程图
O菌体抗原
杂交瘤技术过程
可生产有用抗体的 淋巴細胞 若与 癌细胞融合，则形成稳定而可培 养的细胞株。