细菌内毒素检查法操作规程

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标 准 操 作 规 程

目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围

所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 检验员 内容 1 简述本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品1.1

中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任1.2

何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来1.3 检测或半定量内毒素的方法。 细菌内毒素的量用内毒素单位()表示1.4

系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁1.5 ()细菌内毒素国家标准品 鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试细菌内毒素工作标准品1.6 () 验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。灭菌注射用水。光度1.7 )水凝胶法细菌内毒素检查用水(0.015系指内毒素含量小于 测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005。 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素 鲎试剂灵敏度复核试验1.8

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用表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度, 了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产

1.9

鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是工艺或试验环境

有变化，否存在抑制或增强作用。阳性对照和供试品阳性对照1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、必须同时进行，否则试验结果无效。

2实验材料及用具 0.1以下。2.1 天平供试品称量用，感量为℃以上至少一小时。电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持2502.2

土1℃保持一小时。2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37 1℃以下。2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在旋涡混合器2.5

及细菌内毒素检查用水(符合规定。))2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号，除另有规定外应由中国药()，细菌内毒素工作标准品()细菌内毒素国家标准品2.7

品生物制品检定所统一发放。、三角瓶、小试或刻度吸管，定量移液器实验用具2.8 移液管()、凝集管(10× 75)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、100)(16管×塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒℃干烤至少1小时。砂轮所用玻璃器皿须经250 素方法。 2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、重铬酸钾硫酸洗液。5% 3 操作方法试验准备3.1

3.1.1 配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。洗液的配制将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置3.1.2 玻璃器皿的洗涤

再用新鲜蒸馏水冲洗液中浸泡4取出将洗液滤干，小时，用自来水将残余的洗液洗净，洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。．

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玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至3.1.3 除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内

毒素

达到规定时间后，1小时。250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始记时，须

干烤至少关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可在两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。内毒素限值的确定3.2

(L) 药品、生物制品的细菌内毒素限值一般按以下公式确定

式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以、、或)表示；(活性单位，h)h)表示，注射剂，5((K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以·· h)；0.2(其中放射性药品注射剂K＝2.5(h)，鞘内用药品，··表示，人均体、(h)或(h)h)M为人用每公斤体重每小时最大供试品剂量，以(···小时，按l小时计。60

重按计算，注射时间若小于l可根据生产和临床用药实际情况做必要调如遇特殊

情况，按人用计量计算限值时，

整，但需说明理由。()

3.3 确定最大有效稀释倍数在不超过此稀最大有效稀释倍数是指在试验中供试

品溶液被允许稀释的最大倍数，释倍数的浓度下进行内毒素限度的检测。

用以下公式来确定：λ为供试品的细菌内毒素限值；L当为以表示时当C表示

供试品的浓度，或供试品复溶后所得溶液的浓度。LC11，，可计算C以或表示时，

单位需为或。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则取1L ；供试品的最小有

效稀释浓度λ或是在光度测定法中所使用的标准曲线上，()λ为在凝胶法中鲎试

剂的标示灵敏度最低的内毒素浓度。鲎试剂灵敏度复核3.4

内毒素标准溶液的制备3.4.1

取或一支，轻弹瓶壁，使粉末落人瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻3.4.1.1

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划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。按标准品使用说明书

用移液管加入规定量的水溶解其内容物，用封口3.4.1.2

分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准15膜将瓶口封严。置旋涡混合器

上混合，每稀释一步为所复核鲎试剂的标示灵敏度)0.25λ溶液即2.0、1.0λ、

0.5λ、λ(λ。若为，可按其使用说明)30均应在旋涡混合器上混合秒(详细过

程请参见使用说明书书将其稀释至规定浓度后分装并保存。例如使用(内

毒素含量为9000／支)时的方法如下：151加入的安瓿内，用封口膜将瓶口封严，

置旋涡混合器混合复溶：准确吸取水 9000内毒素标准溶液。分钟，即为内

毒素标准稀释液，得到90010.3稀释：取内毒素标准溶液加上2.7水即为→10

溶液。 1→100稀释液，得到90内毒素标准溶液。水即为→取0.310稀释

液，加上2.7 往后依次类推。也可写成下列格式：

0.3 0.3 0.3 0.3 1 1

→0.590 9000→900→→9→→ 2.7 2.7 2.7 2.4

0.03125 0.25→0.1250.0625→→

秒钟。在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30 3.4.2 待

复核鲎试剂的准备使粉末落支的鲎试剂取3.4.2.1 在制备内毒素标准溶液的

同时，0.118支轻弹瓶壁，防止玻璃屑落人瓶内，75%入瓶底。用砂轮在瓶颈轻

轻划痕，乙醇棉球擦拭后启开备用，水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气

泡。0.1加入支时，按标示量加入水复溶，将复溶后的鲎3.4.2.2 若待复核鲎

试剂的规格不是0.1 75×100.1m1试剂溶液混匀后每分配到凝聚管中，要求至

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