Western主要试剂配制
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1、蛋白提取：
RIPA（裂解细胞和配平蛋白上清浓度）buffer终浓度：（使用时加蛋白酶抑制剂）
50mM Tris-Hcl （PH8.0）
150mM NaCl
1% NP-40
0.5% Sodium deoxycholate
0.1% SDS
EDTA 1mM
蛋白酶抑制剂终浓度：（AP、PeP、leu、NaVO3）1×；Cock tail1×；（NaF、PMSF）10×
2、蛋白上样：
5× Sample buffer（使用时与蛋白上清混合并稀释成1×，煮沸10min冰上2min，用量20ul）：
10% （w/v） SDS
0.5M DTT或（5% β-巯基乙醇）
30% glycerol甘油或丙三醇
250mM Tris-HCl （PH6.8）
0.04% （w/v）溴酚蓝 bromophenoblue
※若为极不亲水蛋白则补加 8M 尿素
3、聚丙烯凝胶电泳胶和缓冲液制备：
SDS-PA GE gel：（具体配方参考分子克隆和协和实验室方法）
上层浓缩胶（80v 15~20min
下层分离胶（100v ？min
Running buffer：
Tris-base 30.3g
Glycine 144.1g 加 ddwater 至1000ml 调定PH 8.3
SDS 10g
Transfer buffer（10×）：
Tris base 30.3g（25mM）
Glycine 144.1g （192mM）
加ddwater 至1000ml 调定PH 8.3
※transfer buffer工作液：
10× stock solution 100ml （稀释成1×）
Methanol甲醇 100~200ml
加ddwater 至1000ml
※转膜条件：300mA 2h或100v 2h 冰库
4、染膜与染胶：
丽春红10×（染膜观察是否有转成）：
丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g
加ddwater至 100ml
使用时将其稀释10倍
考马斯亮蓝（染胶观察是否转全）：
※脱色液：
5、抗体结合与封闭：
封闭液bloting buffer：5%脱脂奶粉或BSA(5g奶粉用100ml TBST1×溶解) 一抗稀释液：5%BSA+ 0.02% NaN3（叠氮钠防腐）（用1×TBST溶解）二抗稀释液：5%脱脂奶粉（5g奶粉用1×TBST溶解）
※一抗封闭液：1:500~1000（视抗体结合强度决定） 4℃过夜或室温6h 以上二抗封闭液：1:5000（视抗体结合强度决定） 1-2h （注意回收和洗膜）10× TBS:
500mM Tris-HCl
1500mM NaCl
调定PH至7.5左右（一般按以上配方接近此值，故不必再调定）
1 × TBST:
10× TBS 100ml
Tween20 1ml
加ddwater 至1000ml
6.曝光与显影