植物组织培养实验

植物组织培养

实验室基本设备：超净工作台；培养室、；洗涤、消毒室，卧式高压消毒锅；温室（培养大棚）；

常用仪器：1.蒸馏水器（学习操作），2.手提式高压消毒锅、卧式高压消毒锅（学习使用、操作），3.天平：⑴药物天平（工业天平）、粗天平、（精密度1/10）⑵分析天平（精密度1/10000），4.超净工作台（学习、使用、操作），5.电热干燥箱（烘箱），6.恒温光照培养箱（学习、操作），7.电冰箱，8.显微镜和解剖镜：①手提式解剖镜（学习、使用、操作）②立体解剖镜③普通显微镜，9.旋转培养机，10. 离心机（学习、使用、操作），11. 酸度测定仪：⑴精密PH4－7 试纸；⑵笔型袖珍酸度计。

必要的器皿：（一）玻璃器皿：1.培养器皿：①试管②三角烧瓶（锥形瓶）③圆形高形培养瓶（罐头瓶）④培养皿⑤扁身培养瓶⑥L 型和T 型管⑦凹面载玻片，2.盛装器皿：①试剂瓶②烧杯，3.计量器皿①量筒②容量瓶③吸管，4.其它器皿滴瓶、称量瓶、漏斗、玻璃管、注射器等实验室常用器皿。（二）金属器械：1.镊子类：①20－25cm 长型镊子（接种或转移愈伤组织）②尖端弯曲“枪型”镊子（镊取较小的植物组织）③尖头钟表镊子和鸭嘴镊子（剥离表皮用）④尖端为小铲状镊子（挖取带琼脂培养基的培养物），2.解剖刀和刀类：①眼科用刀种牛痘疫苗的菱形刀（切割柔软组织中小细胞团）②解剖刀（手术刀）③双面刀片焊接在玻棒上（切取茎尖用）④锋利小刀、大刀和小铁锹，3.剪刀类：①解剖剪②眉剪③眼科剪④18－25cm 弯头剪

⑤俢枝剪，4.接种针。

几种常用药剂的配制：（一）用95%尝试酒精配比不同浓度的酒精的配制。学习配制70%和75%酒精。（二）消毒剂:1. 20%次氯酸钠溶液：称取20g 次氯酸钠用少许水溶解，100ml 水定容。2. 0.1%升汞（HgCl2）溶液：称取0.1g HgCl2少许水溶解，100ml水定容。（三）洗涤剂:1. 2HCl酒精：95%酒精100ml 加入2mlHCl，2.硫酸－重铬酸钾洗液：取10g 重铬酸钾加入蒸馏水90ml，加热溶解冷却后，逐渐加入浓硫酸175ml，放入棕色玻璃瓶备用，（注意：切记不可将盛过洒精，甲醛等原剂的药品玻璃器皿直接泡入洗液在，因为重铬酸钾是一种强的氧化剂，一旦被还原氧化，洗液变绿，失去洗涤作用）。这些器皿必须用自来水冲洗干净并晾干再浸入洗液。（四）1 摩尔浓度（mg/L）NaOH和1 摩尔浓度（mg/L）HCl 配制。

摩尔浓度是指用 1 升（1000ml）溶液中所含溶质的分子量数来表示的溶液的浓度。用M 表示。

1.NaOH 摩尔浓度（M）

NaOH 摩尔质量=分子克数=40g

1M NaOH 是指1000ml 溶液中含有40 克摩尔质量的NaOH，现要配制100ml

（0×0.1＝4g）称取NaOH4g，用少量水解，定容至100ml.

2.HCl 的摩尔浓度

具体配制酸的mol 浓度时，应考虑原浓酸的比重mol 浓度。

要求配制的m ol 浓度×需配制的体积×原酸分子量

V＝————————————————————

原酸的百分浓度×原酸的比重×1000

配制 1.0M HCl100ml，量取38%，比重为 1.19 的HCl8.06ml 加蒸馏水，定容至100ml。

MS 培养基母液配制（单位：毫克mg）:

注意：1．大量元素按照使用时浓缩10 倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2•2H2O 单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml 容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2•2H2O配制同上置于另一小口瓶中。

2．微量元素母液的配制按要求浓缩100 倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4•7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。

3．铁盐配制将FeSO4•7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，不断搅拌，溶解后，两液混合，调pH至 5.5 加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。

4．有机物母液配制，按母液要求浓缩100 倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml 容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。

5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。

6．制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。7．称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。五. 作业

（1）将本次实验内容整理成实验报告。

（2）能不能把所有的母液置于一个瓶里，当作一种母液用于配制？为什么？

（3）在配制大量元素母液时，CaCl2为什么要单独配制？

（4）已知大量元素的母液浓度是原配方浓度的10 倍，在配制1000mlMS 培养基时应取多少毫升母液？

（5）MS 培养基中需加入0.5mg/L 的6-BA，当母液浓度为0.1mg/ml 时，配制1000ml 培养基需要取多少ml6-BA 母液？

配制培养基: 1. 琼脂称取8g 琼脂，加入300ml 蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止。

2.蔗糖3%：称取30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的300ml 蒸馏水中。

3. 各种母液的吸取:

（1）用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2•2H2O母液（B）各100ml

（2）分别用10ml 移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml

（3）用10ml 移液管或吸管吸取有机物（H）10ml

（4）用2ml 移液管吸取生长素NAA1.5ml；用0.5ml 移液管吸取KT0.5ml

将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80℃左右，用酸度计或精密pH 试纸测定培养基的pH 一般要求 5.8~6.0，过酸过碱则用1N NaoH 和1N HCl 调整。分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml 培养基分装70 支试管，即每支试管15ml 左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3 左右）注：培养基勿碰试管壁。包装：分装好的试管用棉塞塞上，包上包装纸，每5~7 支试管捆成一扎，标明培养基代号即可进行灭菌。

①MS+2mg/L 2，4-D +0.8%琼脂（PH5.8）；

②MS+0.5mg/L 2，4-D +0.5mg/L6-BA+0.8%琼脂（PH5.8）；

③MS+0.5mg/L 2，4-D +1.0mg/L6-BA+0.8%琼脂（PH5.8）；

④MS+2 mg/L 2，4-D+0.5mg/L6-BA +0.8%琼脂（PH5.8）；

⑤MS+2mg/L 2，4-D +1.0mg/L6-BA+0.8%琼脂（PH5.8）

幼叶培养:

方法步骤

1. 接种前半小时，可用75%酒精或新洁尔灭喷洒，地板用湿拖把拖刷。超净工作台在接种前用95%酒精揩抹工作台面和有关用具，并先开机鼓风15 分钟后才能使用。

2. 外植体的选择、分离：1．选择无病害的植物叶片（可选择不同种植物叶片）2．用单面刀片或剪刀，解剖刀把叶片从植株上剥离下来，剪成小段置于烧杯中。

3. 外植体的灭菌:超净工作台上将70%酒精倒入装有叶片的烧杯内消毒30s，然后将10%次氯酸钠溶液倒入烧杯内灭菌10 分钟，用无菌水将叶片冲洗三至四次。

4. 外植体的接种与培养:用经过灭菌的剪刀将叶片剪成0.5-1cm2大小的小块置于经过灭菌的培养皿中，打开培养瓶盖子（或试管塞子）用经过灭菌的镊子将外植体置于培养容器内，让外植体与培养基紧密接触，然后盖上盖子并拧紧(或塞上塞子)写上接种日期和外植体名称即转入培养室内培养，室内温度25~30℃，光强为1000~2000LUX,每天光照约14 小时。约一周后观察愈伤诱导情况。

种子培养:

材料、仪器与试剂:1、光照培养箱、超净工作台、2. 三角瓶、培养瓶、镊子、封口塑料、皮筋等3. 1/2MS 或MS 固体培养基、70%酒精、15%的84 消毒液、0.1％的Tween、无菌水等。

方法步骤：1. 选取饱满完好的植物种子；以下步骤均在超净工作台上进行。

2. 将选好的植物种子放入100mL 的三角瓶中，加入70％的酒精浸泡不超过1min ；

3. 沥去酒精后，加入15％的84 消毒液＋0.1％Tween 消毒10 分钟（因品种而异，一般在8-15min）；

4. 沥去消毒液后，用无菌水冲洗3~4 次。

5. 沥干水份，将种子均匀植入1/2MS 固体培养基中，24℃，光强1500lx，光照16h/d。

茎段培养：

材料、仪器与试剂

1. 材料：菊花嫩枝或月季嫩枝

2. 仪器：超净工作台、灭菌锅、显微镜、剪刀、长镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等

3. 试剂：配制好的MS 培养基各种母液、1mol/L 的NaOH、1mol/LHCL 、0.1%的升汞。

①MS+0.2mg/LNAA + 0.8%琼脂（PH5.8）；

②MS+0.2mg/LNAA +0.25 mg/L6-BA+ 0.8%琼脂（PH5.8）；

③MS+0.2mg/LNAA +0.5 mg/L6-BA+ 0.8%琼脂（PH5.8）；

④MS+0.2mg/LNAA +1 mg/L6-BA+ 0.8%琼脂（PH5.8）；

⑤MS+0.2mg/LNAA +1.5 mg/L6-BA+ 0.8%琼脂（PH5.8）

方法步骤

1. 材料的选择；选用的枝条要求表面光滑、无病虫害。

2. 培养步骤：

（1）材料的灭菌：选取长约10 厘米的菊花嫩枝或月季嫩枝于0.1%的升汞溶液中表面消毒15 分