全外显子组测序技术及其在肿瘤研究中的应用

以上方法主要通过捕获芯片或溶液型目标富集 系统完成。捕获芯片作为定向测序的快速有效的方 法，更适用于小型化研究，而溶液型则适用于样品数 量上千的大规模高通量测序研究。 员援 圆摇 全外显子组测序
目前应用的主要测序平台有：砸燥糟澡藻源缘源，陨造造怎皂蚤鄄
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用，故利用适当的基因测序技术，对其进行个体化分 疗存在可能。
型，成 为 未 来 肿 瘤 治 疗 的 一 大 趋 势。栽蚤皂皂藻则皂葬灶灶 等［员苑］发现，由于全外显子组测序可以平行探测微卫
因此，通过全外显子组测序技术获得肿瘤基因 突变相关的最佳药物靶点，改变相应代谢途径，或可
星不稳定性（ 皂蚤糟则燥泽葬贼藻造造蚤贼藻 蚤灶泽贼葬遭蚤造蚤贼赠，酝杂陨）结直肠癌 能成为未来肿瘤个体化治疗的金标准。
宰藻蚤 等［员员］对 员源 位配对的正常人及转移黑素瘤 患者进行比较研究，发现 栽砸砸粤孕 频发突变具有致癌 功能；患者 郧砸陨晕圆粤 突变频率达 猿猿豫 ；突变均发生 在谷氨酸信号通路的编码区域，通过该信号通路的 修饰达到抑制肿瘤生长成为潜在的治疗手段。类似 地，灾葬则藻造葬 等［员圆］在对 苑 例肾透明细胞癌患者的研究 中，发现 杂宰陨 辕 杂晕云 染色质重组复合体基因 孕月砸酝员 作为该肿瘤的第二大癌基因，在患者组截断突变率 达 源员豫 。允燥灶藻泽 等［员猿］通过对 源圆 例卵巢透明细胞癌 患者的肿瘤和正常细胞的对比分析，筛选得到 源 个 基因，孕陨运猿悦粤 编 码 磷 脂 酰 肌 醇鄄猿 激 酶 亚 单 位， 运砸粤杂 与已知癌基因产物相关。孕孕孕圆砸员粤 编码丝氨 酸鄄苏氨酸磷酸酶 圆 的调控亚单位，功能类似癌基
以及 责缘猿 肿瘤抑制基因活性的下调，提示可利用药 物针对 乙 酰 化 辕 去 乙 酰 化 进 行 靶 向 治 疗。栽蚤皂皂藻则鄄 皂葬灶灶 等［员苑］研究显示，结直肠癌中 月砸粤云、运砸粤杂、云郧鄄 云砸圆、酝栽韵砸 等肿瘤药物靶区的基因突变，直接影响 肿瘤药物的治疗效果。孕葬则泽燥灶泽 等［员源］在儿童髓母细
明确肿瘤转移前的时间窗，以期早期发现，预防肿瘤 转移导致的死亡结局［圆园］。 圆援 源摇 选择肿瘤治疗的相关靶点
孕葬泽择怎葬造怎糟糟蚤 等［圆员］关于 月 细胞非霍奇金淋巴瘤
晕 甲基转移酶基因 酝蕴蕴圆 或 酝蕴蕴猿 的钝化突变。该 研究同时揭示了儿童及成人髓母细胞瘤的遗传景观
中最常见类型———弥漫大 月 细胞淋巴瘤以及滤泡 性淋巴瘤的研究中发现，基因组结构的改变使得与
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综述
全外显子组测序技术及其在肿瘤研究中 的应用
陈怡然，摇 吴小华
作者单位：圆园园园猿圆摇 上海，复旦大学附属肿瘤医院 妇瘤科 第一作者：陈怡然，女，复旦大学上海医学院临床医学八年制临床博士研究生，耘鄄皂葬蚤造：蚤糟赠糟澡藻灶赠蚤则葬灶岳 赠葬澡燥燥援 糟燥皂援 糟灶 通讯作者：吴小华，男，教授，主任医师，博士研究生导师，研究领域：妇科恶性肿瘤手术及综合治疗与转化型研究
【 关键词】摇 外显子；摇 测序；摇 肿瘤 凿燥蚤：员园援 猿怨远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员远苑源 原 源员猿远援 圆园员员援 园猿援 园员猿 文章编号：员远苑源 原 源员猿远（圆园员员）园猿 原 园员苑圆 原 园源
摇 摇 随着 圆园园圆 年人类基因组计划的完成，以及其他 种类生物全基因组图谱的陆续描绘，发现不同种群 间的基因差别仅为 员豫 ，主要表现为外显子的差异。 外显子作为蛋白质的编码区，是 阅晕粤 中的重要功能 序列，其仅占人类基因组约 员豫［员］，但涵盖了与个体 表型相关的大部分功能性变异，与人类约 愿缘豫 的导 致疾病的基因突变相关［圆］。全外显子组（ 藻曾燥皂藻）为 人类基因组全部外显子区域的总称，全外显子组测 序（ 憎澡燥造藻鄄藻曾燥皂藻 泽藻择怎藻灶糟蚤灶早）又称为定向外显子组捕 获（ 贼葬则早藻贼藻凿 藻曾燥皂藻 糟葬责贼怎则藻），可选择性的对人类基因 组的编码区进行测序，从而发现罕见及常见疾病相 关的异常基因［猿］。目前，全外显子组测序相比于全 基因组测序，其低成本、高效率的优势日益显著。在 单基因疾病的应用中，其不仅加快单基因缺陷疾病 的基因确定，在系统地预测疾病相关基因方面亦有 应用。对于复杂疾病如肿瘤、糖尿病等的致病基因 和易感基 因 的 测 定 等［源］也 有 相 当 的 应 用 前 景。 本 文主要对全外显子组测序技术以及目前该技术在肿 瘤研究中的应用等问题进行阐述。
的频发突变，潜在错配修复（ 皂蚤泽皂葬贼糟澡 则藻责葬蚤则，酝酝砸） 圆援 缘摇 提示肿瘤预后
机制的 缺 失 甚 至 对 结 直 肠 癌 亚 型 的 高 频 突 变 如
再葬灶 等［圆猿］研究显示，在急性单核细胞性白血病
月砸粤云、运砸粤杂 和 栽孕缘猿 进行测定，使其可能成为未来 （ 粤酝蕴鄄酝缘）患者中，阅晕酝栽猿粤 基因突变导致了 阅晕粤
员援 圆援 员摇 砸燥糟澡藻源缘源摇 即大规模并行焦磷酸合成测序 法，采用 郧杂 云蕴载 系统：每个磁珠通过接头，与一条 大小为 猿园园 耀 愿园园遭责 的 阅晕粤 片段结合构成样品文 库。包含磁珠和扩增试剂的水溶液注入矿物油中， 形成油包水的乳浊液结构，乳浊液 孕悦砸 在每个小水 滴中独立进行，产生几百万相同的拷贝，焦磷酸测序 反应测得每个磁珠上的片段产生一条读长，由此进 行数据分析［远］。 员援 圆援 圆 摇 粤责责造蚤藻凿 月蚤燥泽赠泽贼藻皂泽 杂韵蕴蚤阅 摇 即基于磁珠的 大规模并 行 克 隆 连 接 阅晕粤 测 序 法，采 用 杂韵蕴阅 系 统：利用微珠通过接头捕获 阅晕粤 片段，之后进行乳 液 孕悦砸。其以连接反应取代传统的聚合酶延伸反 应，以 愿遭责 的探针作为连接反应的底物，探针设计为 将 猿忆端 员 耀 圆 位的碱基与 缘忆端标记的荧光信号的颜 色相对应。一次 杂韵蕴蚤阅 测序共为五轮循环测序，每 轮由多个连接反应组成。五轮测序完成后，可得到
上的关键差异。 相比于散发而言，家族性肿瘤的遗传倾向常更
明显，故全面的、无偏倚的蛋白质编码区的基因测序
组蛋白 及 非 组 蛋 白 乙 酰 转 移 酶 高 度 相 关 的 基 因 悦砸耘月月孕 和 耘孕猿园园 钝化，其表达不足造成 月悦蕴远 和 责缘猿 的乙酰化不足，最终导致相关肿瘤蛋白的激活
成为确 定 相 关 责 任 基 因 的 一 种 可 行 方 法。 允燥灶藻泽 等［员缘］对家族性胰腺癌进行测定，发现该家系的 猿 个 独立的截断突变，确立了 孕粤蕴月圆 为家族性胰腺癌的 易感基因。郧燥造凿蚤灶 等［员远］在对肿瘤易 感 家 族 的 研 究 中，对 猿 个黑色素瘤及 圆 个霍杰金淋巴瘤的家族以
员摇 全外显子组测序技术
全外显子组测序技术作为一种新型的基因组分 析技术，包括全外显子组序列捕获及测序。
万方数据
员援 员摇 全外显子组序列捕获 以两种较成熟的方法为例。
员援 员援 员 摇 晕蚤皂遭造藻郧藻灶 外显子序列捕获芯片法摇 基因 组 阅晕粤 被随机打断成片段，随后在 阅晕粤 片段两端 分别连上接头，与定制的序列捕获芯片杂交，去除未 与芯片结合的背景 阅晕粤，将经过富集的外显子区域 的 阅晕粤 洗脱并扩增。 员援 员援 圆 摇 陨灶鄄杂燥造怎贼蚤燥灶 捕获法摇 所要求的基因起始量 低，能有 效 地 捕 获 包 含 未 知 突 变 的 阅晕粤。具 体 步 骤［缘］：（员）基因组 阅晕粤 被打断，并组装成测序平台 特异的文库形式。在捕获之前，对文库的大小进行 选择，并利 用 电 泳 等 方 法 来 进 行 验 证。（ 圆 ）精 选 大 小的文库，随后与诱饵共同孵育 圆源 澡。（猿）加入链 酶亲和素标记的磁珠，并通过强磁铁从混合物中钓 出 砸晕粤 诱饵鄄阅晕粤 杂合体。（源）洗脱磁珠，将 砸晕粤 诱饵降解，将得到的目的 阅晕粤 进行常规的扩增和 测序。
万方数据
圆摇 全外显子组测序技术在肿瘤学方面的应用现状
圆援 员摇 找寻潜在癌基因及抑癌基因，为肿瘤的分子诊 断提供参考
全外显子组测序技术由于对外显子的高覆盖而 获得大量的基因样本。故即使在样本中肿瘤细胞含 量较少和（ 或）样本纯度差异较大的情况下，其仍可 较好的对外显子区域的基因突变进行测定，从而进 一步确定肿瘤相关癌基因及抑癌基因，为肿瘤的早 期诊断提供依据［员园］。
通固定到芯片表面，形成桥结构，之后以寡核苷酸为
引物进行 孕悦砸 扩增，得到单克隆 阅晕粤 族群。测序
中，利用“ 可逆终止子”，使得每个测序循环只掺入
单个碱基，获得各位置单个碱基的信息后，将反应试
剂洗脱，加入新的反应体系，开始下一测序循环［愿］。
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·员苑猿·
灶葬 郧藻灶燥皂藻 粤灶葬造赠扎藻则 Ⅱ，粤责责造蚤藻凿 月蚤燥泽赠泽贼藻皂泽 杂韵蕴蚤阅。
各 位 置 的 颜 色 信 息，从 而 推 断 出 相 应 的 碱 基 序列［苑］。
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员援 圆援 猿摇 陨造造怎皂 蚤灶葬 郧藻灶燥皂藻 粤灶葬造赠扎藻则 Ⅱ摇 即合成测序 法，采用 郧粤 Ⅱ系统。单链的 阅晕粤 片段两端通过接
得筛选该肿瘤的家族易感基因成为可能。 圆援 圆摇 协助肿瘤分型
于 阅粤载载、粤栽砸载、酝耘晕员 等突变导致的染色体重组， 亦显示 员源豫 的该肿瘤患者存在钠巴霉素的靶向通
某些特定肿瘤的基因分型，对之后的治疗方案、 路（ 皂葬皂皂葬造蚤葬灶 贼葬则早藻贼 燥枣 则葬责葬皂赠糟蚤灶，皂栽韵砸）相关基因
靶向药物的选择和治疗结局等都有一定的指示作 的突变，从而使得筛选该类患者进行 皂栽韵砸 抑制治
摇 摇 【 摘要】摇 全外显子组测序作为新兴技术，相比于全基因组测序，其低成本、高效率的优势使得其在
疾病机制的研究中有相当的应用前景。肿瘤作为多基因复杂疾病，其致病机制，分型、治疗、预后、干细 胞特性等均可能与外显子组的变异存在一定关系。全外显子组测序技术可为肿瘤相关性研究提供新思 路。本文对全外显子组测序的技术路线及其在肿瘤学研究中的应用进行综述。
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因。粤砸陨阅员粤 作为肿瘤抑制基因编码产物参与染色 体重构，并且其在 源圆 例患者中突变率 达 到 缘苑豫 。 孕葬则泽燥灶泽 等［员源］在 儿 童 髓 母 细 胞 瘤 的 研 究 中，发 现 员远豫 的髓母细胞瘤的患者中存在着组蛋白鄄赖氨酸鄄
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苑苑豫 ，粤早蚤造藻灶贼 为 愿猿豫 ，并且不同方法的测序亦均有 一定程度的缺失。故目前对于该新型技术的应用，
Baidu Nhomakorabea
尤其是对于实验阴性结果的解释，仍需谨慎为之。
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图 员摇 陨灶鄄杂燥造怎贼蚤燥灶 法捕获外显子组流程［缘］
新一代的测序平台，与传统测序技术相比，利用
接头构建基因文库，在反应基质上进行大规模的并
行 孕悦砸，实现了边合成边测序的可能性。
不可否认的是，全外显子测序技术作为一种新
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型技术，目前其对于全基因组蛋白质编码区的覆盖
并不如设计的理想，允葬糟燥遭泽 等［怨］评估后发现，晕蚤皂鄄
遭造藻郧藻灶 的捕获探针捕获蛋白质编码序列碱基率为
及各家族 员 名远亲对比进行全外显子组的测序，发 胞瘤的研究中，发现一种特别类型的组蛋白甲基化
现每个家族可以获得 园 耀 员园园 不等的候选非同义突 变。通过追踪，对各家族其他成员进行基因分析，使
在该肿瘤形成中的作用，提供靶向抑瘤的研究方向。 允蚤葬燥 等［圆圆］在胰腺内分泌肿瘤的研究中，除了发现关
结直肠癌基因分型的工具。
甲基转移酶的活性降低，并表现出对组蛋白 匀猿 的
圆援 猿摇 肿瘤转移遗传学
异常亲和力。阅晕粤 甲基化作为重要的基因组修饰，
转移作为恶性肿瘤的一大特征，是肿瘤患者死 调控着许多重要细胞过程，其与肿瘤发生的相关性