半夏组织培养体系的建立

第一作者简介：陶米林（１９９０－），女，湖南长沙人，本科，研究方向为植物细胞工程与遗传。Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉａｏｍｉ１９９００５０６＠１６３．ｃｏｍ．责任作者：黄红梅（１９７８－），女，湖南长沙人，博士，讲师，研究方向为植物细胞工程与遗传。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｈｍ７４１８＠１６３．ｃｏｍ．收稿日期：２０１２－１０－２３

半夏组织培养体系的建立

陶米林，刘清波，黄红梅

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙４１０１２８

） 摘　要：

以半夏块茎和顶芽为试材，对顶芽愈伤组织诱导、顶芽愈伤组织不定芽分化、块茎不定芽分化和不定芽诱导生根的最佳条件进行了研究。结果表明：半夏最佳顶芽愈伤组织诱导培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ

／Ｌ；最佳顶芽愈伤组织不定芽分化培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ　１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ／Ｌ；最佳半夏块茎不定芽分化培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ　１．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ

／Ｌ；最佳不定芽诱导生根培养基为ＭＳ＋２，４－Ｄ　２．０ｍｇ／Ｌ＋ＫＴ　１．０ｍｇ／Ｌ。关键词：半夏；组织培养；顶芽；块茎

中图分类号：Ｓ　５６７．２３＋

９　文献标识码：

Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１３）０４－０１１３－０５ 半夏［

Ｐｉｎｅｌｌｉａ　ｔｅｒｎａｔａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｂｒｅｉｔ．］属天南星科半夏属多年生草本植物，主产于四川、湖北、河南、贵州、安徽等省。半夏是中国中药宝库中一种重要及常用的药材，其入药首载于《神农本草经》，距今已有２　０００多年的历史。据统计，在５５８种中药处方中，半夏的使用频率居第２２位。半夏药用部分主要为块茎，含半夏蛋白、生物碱、半夏淀粉、甾醇类、氨基酸、挥发油、芳香族成分、有机酸类、黄酮类、鞣质以及多种微量元素等化学成分，具

燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功能［

１－３

］。由于长期过度采挖，半夏野生资源已近枯竭，远不能满足市场需求，现已进行人工种植。半夏的人工栽培历史较短，始于２０世纪７０年代的山东和江苏等地。半夏人工种植中通常以块茎作生产用种，产量品质逐年下降，而且种源退化严重。而由于半夏是一种长期野生的

中药材，单株间差异很大。为了选育优良的半夏品种（系），可以先从野生植株中选择性状优良的单株，通过半夏组织培养来快速、大规模繁殖优良品种和珍贵种质资源。国内对半夏组织培养的研究，以叶片、叶柄作为外植体的居多。有的研究了植物生长物质种类和浓度等因素对形成小块茎的影响，并分别筛选出合适的培养基配方；有的则比较了叶片、叶柄、顶芽、块茎等不同外

植体，诱导愈伤组织的效果［

４

］。因此，在前人基础上，需要进一步探讨如何高效和最大限度地利用优良单株有限的组织器官进行大规模繁殖、遗传改良和次生代谢物开发利用问题。该试验通过研究不同激素种类和浓度配比对半夏组织培养的影响，以期进一步完善半夏组织培养体系，更好地为后续相关研究奠定材料和技术基础。

１　材料与方法

１．１　试验材料

该试验以野生半夏为试材，采自湖南农业大学校园内，以半夏顶芽及块茎为外植体。

３

１１

１．２　试验方法

１．２．１　试验材料的灭菌与外植体制备　接种前先用刀片将半夏块茎外皮去掉，清水洗净。然后转入超净工作台，用体积分数为０．１％的ＨｇＣｌ２溶液浸泡２０ｍｉｎ，再用无菌水冲洗３～４次。发芽的块茎，将顶芽完整切下后用清水洗净，转入超净工作台后用体积分数为０．１％的ＨｇＣｌ２溶液浸泡１５ｍｉｎ，再用无菌水冲洗３～４次。在无菌滤纸上将块茎切成０．５～１ｃｍ２左右的小块，顶芽切成１～２ｃｍ左右的小段，备用。

１．２．２　愈伤组织诱导　无菌条件下，将上述顶芽外植体分别接种到含有不同植物生长调节剂配比的培养基上（表１）。每个处理４瓶，每瓶接种４个顶芽外植体。置于组织培养室中培养，定期观察愈伤组织生长情况，并对试验现象进行记录，２８ｄ后统计出愈率及出愈量。１．２．３　愈伤组织的增殖与不定芽分化培养　将愈伤组织于增殖培养基中继代培养使其增殖。待愈伤组织增殖到一定数量，以不同浓度植物生长调节剂组合（表２），诱导愈伤组织分化出不定芽以及对不定芽进行增殖，每个处理４瓶，每瓶２块愈伤组织，置于组织培养室中培养。定期观察不定芽分化及不定芽生长情况，２１ｄ后统计不定芽增殖系数。

１．２．４　块茎的不定芽诱导　将块茎外植体接种至含有不同浓度植物生长调节剂组合的培养基（表３），诱导不定芽分化及对不定芽进行增殖，每个处理４瓶，每瓶４块，置于组织培养室中培养。定期观察不定芽分化及不定芽生长情况，２１ｄ后统计不定芽增殖系数。１．２．５　不定芽的生根培养　当不定芽生长至２～５ｃｍ高时，将其转移到添加不同植物生长调节剂的生根培养基中（表４），观察并记录不同的植物生长调节剂对植株生根的影响。每个处理４瓶，每瓶１棵试管苗。置于组织培养室中培养。定期观察不定芽生根情况，１４ｄ后统计不定芽生根率。

１．２．６　练苗与移栽　待试管苗长至４～６ｃｍ高时，打开瓶口，于培养室中放置３～５ｄ。用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部培养基，然后涝出，放入干净的小盆中。将小苗移栽入花盆中，轻轻覆盖、压实，置于阴凉、干燥、通风的培养环境中，常浇水，保持土壤湿润。

１．２．７　培养条件　以上培养基均为ＭＳ基本培养基，琼脂浓度均为７ｇ／Ｌ，蔗糖浓度均为３０ｇ／Ｌ。培养基的ｐＨ均为５．６，配制好的培养基经１２１℃，２２ｍｉｎ的高温高压灭菌后使用。培养条件：培养室温度（２６±２）℃，光照强度２　０００～２　５００μｍｏｌ·ｍ－２·ｓ－１，光照时间１２ｈ／ｄ。

１．３　数据分析

试验数据用Ｅｘｃｅｌ　２００３软件工具栏中的数据分析

进行差异显著性分析。其中，出愈率＝产生愈伤组织的外植体数／外植体数×１００％；不定芽增殖系数＝出芽数／外植体数×１００％；生根率＝生根瓶数／接种不定芽数×１００％；平均生根条数＝总生根条数／接种不定芽数。

２　结果与分析

２．１　激素浓度配比对半夏顶芽愈伤组织诱导的影响以半夏顶芽为外植体诱导愈伤组织，在接种３～５ｄ后，顶芽两端向上跷起，随后有切口的一端膨大（图１－１）。接种１０～１２ｄ后，可见顶芽有所增长，其切口端出现白色绒毛状物。第１５天后，渐渐出现淡黄或透明的松散型愈伤组织（图１－２）。将愈伤组织切下于同样的培养基中进行增殖培养。由表１可知，处理８顶芽出愈率最高，且出愈量较大。从处理５～１２的出愈率可以看出，当ＮＡＡ浓度相同时，６－ＢＡ浓度越大，愈伤组织出愈率越高；当６－ＢＡ浓度相同时，ＮＡＡ为０．２ｍｇ／Ｌ时，出愈率普遍较高，且试验中观察到６－ＢＡ与ＮＡＡ组合较２，４－Ｄ与ＫＴ组合的愈伤组织更接近胚性愈伤组织。经过差异显著性分析表明，各处理间的出愈率差异显著，其中出愈率最高的为处理８，即６－ＢＡ　２．０ｍｇ／Ｌ和ＮＡＡ０．２ｍｇ／Ｌ为半夏顶芽愈伤组织诱导的最适宜激素浓度。

表１激素浓度配比对半夏顶芽

愈伤组织诱导的影响

Ｔａｂｌｅ　１Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ　ｏｎ

ｔｈｅ　ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｂｕｄ　ｏｆ　Ｐｉｎｅｌｌｉａ　ｔｕｂｅｒ

处理

ＮＡＡ

／ｍｇ·Ｌ－１

６－ＢＡ

／ｍｇ·Ｌ－１

２，４－Ｄ

／ｍｇ·Ｌ－１

ＫＴ

／ｍｇ·Ｌ－１

接种数

／个

出愈率

／％

出愈量

１

２

３

４

５

６

７

８

９

１０

１１

１２

１３

１４

１５

１６

０

０

０

０

０．２

０．２

０．２

０．２

０．５

０．５

０．５

０．５

０

０

０

０

０．５

１．０

１．５

２．０

０．５

１．０

１．５

２．０

０．５

１．０

１．５

２．０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０．２

０．２

０．５

０．５

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

０

１．０

２．０

１．０

２．０

４８

４８

４８

４８

４８

４８

４８

４８

４８

４８

４８

４８

３２

３２

３２

３２

０．０ｓ

０．０ｓ

０．０ｓ

０．０ｓ

１２．５ｑｒ

４３．８ｈｉｊ

６８．８ｃｄ

８７．５ａ

２８．１ｏｐ

４０．６ｉｊｋ

６２．５ｅ

７１．９ｂｃ

３１．３ｌｍｎ

５６．３ｆ

４６．９ｇｈ

７５．０ｂ

无

无

无

无

＋

＋＋

＋＋＋

＋＋＋＋

＋

＋＋

＋＋

＋＋＋

＋

＋＋

＋＋

＋＋＋

注：同列不同小写字母表示差异显著（Ｐ＜０．０５）。“＋”表示愈伤组织发生量；“＋”越多，表示愈伤组织发生量越多。下同。

２．２　激素浓度配比对顶芽愈伤组织不定芽分化的影响将愈伤组织接种于培养基上，７ｄ后发现，半透明的松散型愈伤组织上出现淡绿色芽点（图１－３）；１５ｄ后淡绿色芽点渐渐密集；２１ｄ后愈伤组织长出大量嫩绿色的

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