三叶半夏组培苗的病毒检测

中图分类号：S567.2
文献标识码：A
文章编号：1001－7119（2010）01－0104－05
Detection of Viruses from Tissue-culturing Plantlets of Pinellia ternata（Thunb.）Breit.
GUO Qiaoping1，2，TANG Xiangshan2，CHEN Jishuang2*
为建立三叶半夏种苗工厂化扩繁过程中脱 毒效率和质量控制的方法，通过组织培养快速培 育无毒三叶半夏种苗，本研究对不同病毒检测方 法进行比较，以期获得三叶半夏组培苗的高灵敏 度和高通量检测方法。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂 实验的检测材料是不同地区野生三叶半夏
植株，经组织培养再生的生根时期组培苗，样品 编 号 和 采 集 地 见 表 1，TRIzol 试 剂 购 自 Invitrogene 公司，AMV（Avian Myeloblastosis Virus）反转 录酶购自 Takara 公司，CMV、SMV 抗体试剂盒购 自 Agdia 公司。 1.2 双抗体酶联免疫吸附（DAS-ELISA）检测
（1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 211810， China； 2. Institute of Bioengineering， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）
GTWTGGTG-3′（Y=T/C，W=T/A）；
SMVPrimer4：5′
-YTYGCAGTRTGCC-
TYTCAGT-3′（Y=T/C，R=A/G）。
1.3.2 病毒 RNA 模板的制备 取 0.5 g 新鲜叶片
组织，用 TRIzol 试剂提取叶片组织中的总 RNA。
1.3.3wk.baidu.comcDNA 的合成和 PCR 扩增 RT-PCR 具体
摘 要：组织培养阶段植物细胞中的病毒含量较低，难以用常规方法进行可靠检测。 本研究采用 DASELISA、RT-PCR 和核酸杂交三种方法对不同来源的 12 个三叶半夏（Pinellia ternata （Thunb.）Breit.）组培 苗样品中的黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus， SMV） 进行比较检测。 结果显示：经 DAS-ELISA 检测，4 个样品携带 CMV，4 个样品携带 SMV，1 个样品同时携 带 2 种病毒； 经 RT-PCR 检测，5 个样品携带 CMV，6 个样品携带 SMV，1 个样品同时携带 2 种病毒；经 核酸杂交检测验证，其结果与 RT-PCR 的检测结果一致。 可见，对于三叶半夏组培苗，DAS-ELISA 检测 灵敏度不够高，需用灵敏度更高和特异性更强的核酸杂交方法来对其进行病毒检测，确保检测结果准 确可靠。 关键词：三叶半夏；组培苗；黄瓜花叶病毒；大豆花叶病毒；病毒检测
Vol.26 No.1 Jan. 2010
科技通报
BULLETIN OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
第 26 卷 第 1 期 2010 年 1 月
三叶半夏组培苗的病毒检测
郭巧萍 1，2，唐香山 2，陈集双 2*
（1． 南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 211810；2． 浙江理工大学 生物工程研究所，杭州 310018）
操 作 如 下 ： 反 应 体 系 为 RNA 模 板 3 μL，CMV
Primer2 0.5 μL，SMV Primer4 0.5 μL，ddH2O 2.9 μL，混 合 均 匀 后 70 ℃保 温 10 min，冰 浴 2 min；
加 入 5×AMV Buffer 2 μL，dNTPs （10 mM） 0.5
收 稿 日 期 ：2009－02－23 基 金 项 目 ： 国 家 “863”项 目 （2002AA24112A ） 作 者 简 介 ：郭 巧 萍 （1983-），女 ，浙 江 义 乌 人 ，南 京 工 业 大 学 生 物 与 制 药 工 程 学 院 ，从 事 半 夏 组 织 培 养 与 脱 病 毒 研 究 。 E-mail: zjlgdxgqp@yahoo.com.cn * 通讯作者：陈集双（1965-），男，湖南，教授，博士生导师，从事植物病毒和脱毒快繁研究。 E-mail:chenjs@zust.edu.cn
Abstract：The concentration of viruses in plant cells are induced during tissue culturing periods， and it is difficult to use conventional methods for reliable detection. We used DAS-ELISA， RT-PCR and nucleic acid hybridization after PCR amplification to test Cucumber mosaic virus （CMV） and Soybean mosaic virus （SMV） from tissue-culturing plantlets of P. ternata. Among twelve seedling lines， CMV was detected from four seedling lines， SMV was detected from four seedling lines， while we found one seedling line was complexly infected by both viruses. RT-PCR detection using primers corresponding to coat protein gene of a penellia strain of CMV and a penellia strain of SMV respectively， resulted five cases of CMV infection and six cases of SMV infection， one seedling line of complex infection by both viruses. Using RT-PCR products for further confirmation by nucleic acid hybridization， the same results were obtained with RT-PCR. The above results show that the sensitivity of DAS-ELISA detection is not enough for detecting tissue-culturing plantlets of P. ternata. In order to ensure the accuracy and reliability of seedling quarantine， nucleic acid hybridization after amplification of viral RNAs， with higher sensitivity and specificity is required. Key words：Pinellia ternata （Thunb.）Breit.；tissue-culturing plantlet；Cucumber mosaic virus；Soybean mosaic virus；virus detection
2.1 DAS-ELISA 检测 以 12 个 三 叶 半 夏 组 培 苗 样 品 为 材 料 ， 用
106
科技通报
第 26 卷
DAS-ELISA 方 法 进 行 CMV 和 SMV 的 病 毒 检 测 ， 检测结 果如表 1 所示 ：12 个 三 叶 半 夏 组 培 苗 样 品 中 ，4 个 样 品 检 测 到 CMV，4 个 样 品 检 测 到 SMV，7 个 样 品 检 测 到 病 毒 ，BX6 同 时 检 测 到 CMV 和 SMV。 检 测 结 果 表 明 三 叶 半 夏 易 受 单种病毒侵染，同时被多种病毒复合侵染的几 率较低。 2.2 RT-PCR 检测
三叶半夏组培苗样品的 DAS-ELISA 检测参 照王海丽等所述的方法［3］，阳性对照为感染 CMV 的烟草和感染 SMV 的大豆， 阴性对照为脱病毒 的半夏，空白对照为 PBST 缓冲液。 每个样品设 置三个重复。 1.3 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 1.3.1 引物设计 根据 Genbank 已登录的序列， 在 CMV 和 SMV 的 CP 核苷酸序列的两端选其保
PCR 反 应 体 系 ：10 ×PCR Buffer 2.5 μL，
dNTPs （10 mM） 1 μL，CMV Primer1 1 μL，CMV
Primer2 1 μL，SMV Primer3 1 μL，SMV Primer4 1
μL，cDNA 模 板 2.1 μL，Taq 酶 （5 U/μL） 0.4 μL，
以 1.3 所述的 PCR 产物为核酸杂交材料，核
酸杂交检测参照杜志游等所述的方法［6］。 阳性对
照 为 克 隆 的 CMV 质 粒 和 SMV 的 PCR 产 物 ，阴
性对照为以双蒸水作模板的 PCR 产物。 每个样
品设置三个浓度梯度（原液、1/2 稀释、1/4 稀释），
每个梯度设 3 个重复。
2 结果分析
MgCl2（25 mM） 0.5 μL，ddH2O 15.5 μL；PCR 反应 条件：94 ℃预变性 2 min，94 ℃ 40 s，56 ℃ 30 s，
72 ℃ 1 min， 循环 30 次，72 ℃延伸 10 min，4 ℃
保存。 取 5 μl PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳
检测。
1.4 核酸杂交检测
μL，RNase Inhibitor （40 U/μL） 0.3 μL，AMV Re-
verse Transcriptase（5 U/μL） 0.3 μL，将反转录体
系 于 42 ℃保温 60 min，70 ℃保温 15 min，cDNA
合成后置于冰上或 4 ℃保存， 作为进一步 PCR
扩增的模板。
第1期
郭巧萍等.三叶半夏组培苗的病毒检测
105
0 引言
三叶 半 夏 （Pinellia ternata （Thunb.）Breit.）为 天南星科半夏属植物，主要以块茎或珠芽进行无 性繁殖，在人工栽培过程中易受病毒侵染。 组织 培养技术可脱除三叶半夏植株中所携带的病毒， 但脱毒处理后的三叶半夏仍需进行病毒检测。 据 研究报道，侵染我国半夏的病毒主要为黄瓜花叶 病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）半 夏 株 系 和 大豆花叶病毒 （Soybean mosaic virus， SMV）［1-2］。 该两种病毒侵染半夏时虽有重组和适应性变异， 但大部分序列是保守的，这为核酸杂交等分子检 测方法提供了条件。 DAS-ELISA、PCR 和 RT-PCR 是 植 物 病 毒 检 测 的 常 规 方 法 ， ［3-5］ 而 近 年 来 建 立 的核酸杂交的方法在进行单一病毒的多样品检 测时无需放射性同位素且特异性强。 我们已用该 方法对 CMV 和亚病毒卫星进行了检测， 但未进 行组培苗的病毒检测。
守序列设计引物。 引物委托上海生物工程公司合
成。 其序列如下：
CMVPrimer1：5′ -ACYVTTAACCACCCAAC-
CTT-3′（Y=T/C，V=A/C/G）；
CMVPrimer2：5′ -AGCTGGATGGACAACC-
CGTTC-3′；
SMVPrimer3：5′ -ATGAATGGYTTYATG-