抗体制备方法的研究进展

4 Guy J Hallman,Paisan Loaharanu.Generic Ionizing Rad-i

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5 Peter A Follett and Suzanne S Sanxter.Hot Water Immer-sion to Ens ure Quarantine Securi ty for Cryptophle bia spp. (L epidoptera:Tortricidae)in Lychee and Longan Export-ed from Hawaii.Stored-Product and Uarantine Entomolo-gy,S tord-Product And Uarantine Entomology,2001,94 (5):1292~1295

抗体制备方法的研究进展

邵碧英

(福建出入境检验检疫局 福州 350001)

由于抗体的反应特异性,抗体的应用广泛,不仅是细菌、病毒、外源蛋白等的诊断和检测试剂,而且还是人和动物某些疾病的诊断试剂和有效治疗药物。抗体制备方法经历了常规血清技术、杂交瘤技术、基因工程抗体技术及抗体库技术,本文将分别阐述。

1 常规血清技术

常规的抗体制备包括抗原的制备、免疫动物、抗血清制备及特异抗体纯化等步骤。获得的抗体是针对多个不同抗原决定簇的抗体混合物,因此称之为多克隆抗体,简称多抗。制备抗体,关键是获得高产量、高纯度的抗原。抗原的获得方法有以下几种。

1 1 抗原提取剂

若抗原易获得,或易提纯,则可采用抗原提取剂制备抗体。以制备病原体的抗体为例,若以整个病原体作为抗原,只需对其进行分离、纯化,而以其某部分如菌丝可溶性蛋白、病毒的外壳蛋白等作为抗原,则要采用相应的提取方法。低分子量物质需与大的载体偶联后才可形成完全抗原。陈京等[1]将提纯的番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和南芥菜花叶病毒分别免疫兔子,制备的抗血清用于3种病毒的检测。陈松等[2]将从苏云金杆菌菌体中提取的Bt蛋白作为抗原,制备的抗血清用于检测转基因棉花中的Bt蛋白。氯霉素(GAP)是小分子物质,石德时等[3]将GAP 和牛血清白蛋白偶联作为抗原制备了抗血清,用于检测动物性食品中的GAP残留。

1 2 人工合成的多肽

若目的蛋白的氨基酸序列已经清楚或可从相应的核苷酸序列推导,则可合成短肽,与载体蛋白偶联后作为抗原。许家喜等[4]在计算机辅助下根据外源基因cDNA序列预测出蛋白抗原位点肽,人工合成后制成复合抗原,免疫家兔后获得特异性抗体,用于测定转基因植物中外源基因的表达产物。

1 3 基因工程抗原

若病原体难培养或抗原不易提取,则可采用基因工程抗原,制备的一般程序是:克隆抗原基因,构建表达载体,转化受体,使抗原基因得到表达,表达产物经适当纯化即可作为抗原。制备基因工程抗原,关键是选择适当的表达系统。表达系统有以下几种。

1 3 1 原核细胞表达系统:原核细胞表达系统有大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、蓝细菌等,既可表达原核基因,又可表达真核基因。其中,大肠杆菌最常用,具有经济、易操作、研究和生产周期较短等优点。

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2 真核微生物表达系统:真核微生物表

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收稿日期:2003-02-20

达系统有酵母、曲霉等。常用的是酵母表达系统,主要有酿酒酵母和甲基营养型酵母2类,具有可在简单培养基中快速生长、可分泌有功能的完全折叠的异源蛋白等优点。

1 3 3 昆虫细胞表达系统:昆虫细胞表达系统是以昆虫杆状病毒为载体,以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统,具有对人、畜安全,外源基因容纳量大、可被高效表达等优点。常用的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV),极易在离体培养的草地夜蛾(Sf)细胞中增殖。

另外,还有哺乳动物细胞表达系统。

2 杂交瘤技术

20世纪70年代发展了杂交瘤技术后,单克隆抗体(简称单抗)在医学及生物学各领域得到广泛应用。制备单抗的一般程序是,将抗原免疫小鼠,从超免疫的供体中获取脾细胞,再与带有遗传标记并已适应于组织培养的骨髓瘤细胞融合,然后测定杂交细胞混合群体分泌抗体的能力,最后对单个细胞进行克隆建株。

我国也已制备出多种以植物病原物为抗原的单克隆抗体。单抗的特异性非常高,不同批次的差异很小。分泌特异单抗的杂交瘤细胞系一旦建立可长期冻存,并可随时制备。但此方法存在杂交瘤的融合与筛选费时费力、成本高、工艺复杂等缺点。

3 基因工程抗体技术

基因工程技术的飞速发展为单抗的生产提供了一条新途径。在基因水平上对抗体基因进行切割、拼接、修饰或通过人工合成的方法构建各种抗体基因的表达载体,并通过不同的转基因技术使之在受体细胞中得以表达。许多适用抗原表达的系统都适于抗体的表达,这里主要介绍以下3种。

3 1 原核表达

原核细胞表达系统不能对表达的抗体分子进行糖基化修饰、肽链组装和正确形成二硫键,因此不能用来表达完整的抗体分子,而适于表达Fab、单链抗体(scFv)等功能性抗体片段。一般程序是,人工分离单抗或其部分基因,用特定的连接肽连接,然后在受体中表达。大肠杆菌是最常用的表达系统。曾君祉等[5]应用大肠杆菌表达系统制备了甜菜坏死黄脉病毒的单链抗体。

3 2 转基因植物表达

利用转基因技术,通过植株再生系统,已实现了抗体基因在植物细胞和植物体内的表达。一般程序是将轻、重链抗体基因分别导入表达载体并转化植物,再将表达轻、重链抗体的植株进行有性杂交,后代可产生有完整功能的抗体,也可通过双重转化植物使全抗体获得表达,或将轻、重链可变区基因串联,在植物中表达出单链抗体。van Engelen 等[6]将真菌角质酶抗体的轻、重链cDNA和分泌信号序列融合后克隆到表达载体中,转化到烟草上,产生了功能抗体。T avladoraki 等[7]将抗菊芋斑驳皱缩病毒的scFv基因转化烟草并获得表达,转基因植物可减少病毒的侵染、延缓症状的表现。在植物中表达抗体可大规模而廉价地生产抗体,并为防治植物病害提供了新途径,前景诱人。

3 3 转基因动物表达

人们多用转基因鼠来生产单抗,主要有2种方法,一是分别将小鼠胚系的抗体轻、重链基因破坏,插入目的抗体轻、重链基因,杂交后即可获得同时含有2类目的抗体基因的小鼠,经抗原免疫即可获得特异性抗体。另一方法是将轻、重链基因通过脂质体导入或原生质体融合入小鼠胚胎干细胞,获得含目的抗体的轻链和重链的小鼠,后与内源性轻、重链双缺失的小鼠杂交,可筛选到能产生目的抗体的小鼠。

4 抗体库技术

4 1 噬菌体展示技术(phage display)

随着基因工程抗体技术的深入发展,20

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