生化设计实验

紫外分光光度法测定花生奶蛋白质含量

一、实验目的

1.通过检测市场上贩卖的乳制品中蛋白质的含量为人们日常生活中的营养搭配以及食品选购提供帮助；

2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术，熟练紫外分光光度法检测技术以及定量技术；

3.尝试可以建立一种非蛋白质类含氮物质对测定结果无干扰的乳与乳制品中蛋白质含量的快速测定方法；

二、实验原理

1.紫外-可见分光光度法：是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。波长长（频率小）的光线能量小，波长短（频率大）的光线能量大。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。

2.由于乳与乳制品的蛋白质中有游离的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故,在280 nm 波长处有特征的最大吸收,其吸收强度与样中蛋白质含量呈正比。利用这个特异性吸收,在280 nm 波长处,用1 cm比色杯测得吸光度值。据此,计算出蛋白质的含量。

3.双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，可以用比色法进行测定。双缩脲法最常用于需要快速但并不需要十分精确的测定。

三、仪器与试剂

1、仪器①紫外分光光度计②石英比色皿③微波振荡器。

2、试剂①9 g/L 氯化钠溶液②蒸馏水③双缩脲试剂:溶解0.15g硫酸铜

（CuSO

4·5H

2

O）和0.6g酒石酸钾钠（NaKC

4

H

4

O

6

·4H

2

O）于50ml蒸馏水中，在搅拌

下加入30ml10％氢氧化钠溶液，用水稀释到100ml，贮存于内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保存。④标准蛋白溶液（10μg/ml）准确称取牛血清蛋白用

0.0001mol/L氢氧化钠溶液配制，冰相存放备用.

四、操作步骤

1、标准应用曲线的绘制:

取6支干净的试管，按0→5编号，然后按下表依次加入试剂，充分混匀，在室温下放置半小时，以0管为空白，在280nm波长处测定消光值（OD），以各管蛋白质含量（毫克）横坐标，OD值为坐标，画出标线。

2、样品测定:

吸取花生饮料1.00 ml 置于100 ml容量瓶中, 加入9 g/L 氯化钠溶液至刻度,混匀。再从中吸取10.00 ml样品溶液于100 ml容量瓶中,加入9 g/L 氯化钠溶液至刻度,微波振荡5 min,混匀。用定性滤纸过滤,弃去初滤液30 ml,收集滤液备用。用9 g/L 氯化钠溶液做空白调零,在280 nm波长处,用1 cm 石英比色皿测得吸光度值。记录花生饮料的吸光度值,从工作曲线上查出或用计算标准回归方程计算出测定样品溶液中蛋白质含量C。

五、注意事项

⒈石英比色皿比较贵重且易碎，所以使用时要小心；

⒉绘制标准曲线时蛋白质溶液浓度要准确配制作为标准溶液；

⒊测量吸光度时比色皿要保持洁净切勿用手玷污其光面；