8 15基因打靶
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Neo 编码的新霉素磷酸转移酶 G418 一种与新霉素结构相似的氨基糖类抗生素
东北师范大学
正向选择法
载体上有缺失自身调控因子的正向选择 基因，只能在整合后利用靶位点上相应 的表达调控元件启动表达。 例如去掉启动子和起始密码子。结果： 随机整合1—选择标记基因表达受阻 随机整合2—刚好整合在其它基因调控 元件部位，启动选择标记基因表达。 同源重组—重组位点正确，基因表达。 用酶切图谱或印迹杂交鉴定重组克隆。
东北师范大学
正负双向选择法
定点整合 细胞存活 阳性标记 阴性标记 同源区外区域被切除 细胞对正负药物均有抗性 随机整合 细胞死亡
整个载体插入
细胞死于负选择药物
东北师范大学
Hprt+/Hprt-正负双向选择系统
Mario Capecchi, Oliver Smithies
细胞内次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶（hprt)常作为打靶基因报告基因。 正常细胞（Hprt+）能在HAT培养基中 生长，作为正向选择标志。利用补救途径 改造细胞（Hprt-）能在6-TG培养基中 生长，作为负向选择标志。弥补补救途径 HAT：次黄嘌呤,甲氨喋呤,胸腺嘧啶 6-TG: 6-巯基鸟嘌呤
常 用 干 扰 型 突 变
东北师范大学
基因插入型载体
gene-insertion vector
正向选择标记在同源序列外侧，重组 结果是整个载体整合到靶位点上，从 而干扰目标基因的功能。功能性删除。
东北师范大学
基因治疗型载体
Vector in gene therapy
载体上有取代基因，对基因突变而丧 失正常功能基因的纠正。
东北师范大学
组织特异性启动序列
两个LoxP之间含有 靶基因的转基因动物 含受控于组织特异性 启动子的Cre转基因动物
东北师范大学
组织特异性启动序列
Cre只在脑组织中表达
东北师范大学
条件性基因敲除
conditional knockout
Cre-LoxP与FLP-frt系统合用
东北师范大学
条件性基因打靶
东北师范大学
基因捕获载体
SD SA
克隆模板
报告基因提供剪接受体SA，与靶基因剪接供体 SD作用，产生靶基因上游与报告基因的融合转 录本，以此作为克隆突变基因序列的模板。
东北师范大学
启动子捕获载体
当载体插入到内源基因编码区 序列时报告基因才可能表达 。
东北师范大学
增强子捕获载体
含有启动子和翻译起始位点的载体整合到增 强子附近时，增强子可调控报告基因的表Leabharlann Baidu。
东北师范大学
Cre-LoxP的剪切、倒位、交换或易位
方向相同-切除
方向相反-倒位
如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或 染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或易位。
东北师范大学
Cre-LoxP的剪切与倒位机理
东北师范大学
Cre-LoxP的四种功能
东北师范大学
ROSA位点转基因小鼠
东北师范大学
基因置换型载体
gene-replacement vector
正向选择标记在同源序列内侧，重组 结果是载体上的同源序列取代靶序列。
东北师范大学
基因置换型载体
置换型载体线性化点位于同源序列外 侧，结果是载体同源序列取代靶序列。
常 用 于 敲 除 突 变
东北师范大学
基因插入型载体
插入型载体线性化点位于同源序列内 部，重组结果是整个载体插入到基因 组序列内部，干扰了目标基因的功能。
一种商品化的转基因小鼠。小鼠六号 染色体ROSA26基因是在所有组织中都 能编码一种非必需的核RNA。在该位 点进行基因嵌入建立的多用途的条件 性转基因小鼠模型，受到广泛重视。 由于动物与基因操作位点的统一，克 服了由于动物品系、整合位点及整合 效率不同等影响因素对试验结果及重 复性的影响。
东北师范大学
HAS-TK：产物能转化GCV而杀死细胞。 HAS-TK插入到载体的重组区外侧，同源 重组时TK丢失。随机整合时，整合部位 同时获得neo和HAS-tk两个基因，加入 GCV后细胞死亡。 未整合： neo-/tk-，细胞在G418中死亡。 随机整合：neo+/tk+，细胞在GCV中死亡。 同源重组：neo+/tk-，两种药物均存活。
东北师范大学
基因打靶技术
打靶载体的构建
胚 胎 干 细 胞 基 因 打 靶
囊胚注射 胚胎移植
筛选中靶细胞
F0 首建鼠
筛选动物及表型分析
回交
东北师范大学
同源重组
homologous recombination
发生在DNA同源序列之间或有相同或近似 碱基序列之间的遗传交换。要有重组酶 等一系列酶等的参与。(RecA)
一种人为控制转基因动物打靶时间的 基因打靶方式。 将Cre基因置于可诱导启动子控制下， 在任意时间通过诱导剂诱导表达Cre重 组酶，完成LoxP之间的基因操作。 将Cre基因受控于可诱导的组织特异性 启动子，加之诱导剂的精准注射，则 能更好地实现时空特异性基因打靶。
东北师范大学
标记基因定点突变筛选
靶细胞基因组存在负选择标记基因。 打靶载体有能插入负选择标记基因的同 源序列和正选择标记基因，导入受体细 胞后用两种药物进行筛选。结果如下： 未整合细胞在任一药物中全部死亡。 随机整合细胞在负选择性药物中死亡。 同源重组细胞在两种药物中均能存活。 因为同源重组造成细胞固有的负选择标 记基因失活。
（Mario Capecchi） (Oliver Smithies) （Martin John Evans） 东北师范大学
马丁·约翰·埃文斯
马里奥· 卡佩奇
奥利弗· 史密西斯
基因打靶技术的优点
位点精确度高：精确的定点修饰，克服 了随机插入对相邻序列的不良影响。 定量精确度高；拷贝数确定，避免了缺 乏量化概念的随机导入。 稳定性强：确保整合至染色体稳定遗传。 具有时空性：打靶效应具有发育特异性、 组织特异性和人为操控性。
东北师范大学
染色体内同源重组的结局
1
1
2
2
2 1
一个DNA分子上两个特异位点之间发生重组，会得到两种结果： 两个位点之间的片段被颠倒，两个位点之间的片段被丢失。
东北师范大学
双置换法( in and out)
in
第一次基因置换后正筛选
out
第二次基因置换后负筛选 除置换基因外不留无关序列
东北师范大学
东北师范大学
正负双向选择法
载体正向选择基因位于同源区内，随 机整合与同源重组时均表达。负选择 基因位于同源区之外，同源重组时被 切掉，而随机整合时被保留。
无整合: 细胞被正性选择药物杀死；
随机整合:细胞被负性选择药物杀死；
同源重组:对正性和负性药物均有抗性。
东北师范大学
neo/tk正负双向选择系统
采用来自酵母的FLP-frt系统
突变序列 置换序列
被置换序列
标记基因去除
东北师范大学
酵母FLP-frt系统
LoxP 与 FRT
东北师范大学
条件性基因打靶
Conditional gene targeting
一种针对转基因动物特定组织或发育 特定阶段的基因打靶方法。 基因打靶有时会严重影响胚胎发育， 由于是对整体细胞打靶，因此也很难 将成体表型归于哪类组织细胞，更难 排除由于发育缺陷引起的表型。 条件性基因打靶可以克服上述局限性。 动物1: Cre转基因动物。 动物2：两个LoxP之间含有靶基因的 转基因动物
姊妹染色单体交换 非 姊 妹 染 色 体 交 换
东北师范大学
DNA同源重组模型
Holliday junction Robin Holliday 1932-2014
Meselson-Radding, DSBR, SSA
东北师范大学
基因打靶的原理（敲除）
基因打靶载体 靶标
选择性标记
进入细胞核
两端同源序列重组
东北师范大学
基因治疗临床试验
东北师范大学
基因治疗临床试验
东北师范大学
基因捕获gene trap
将报告基因随机插入基因组，通过内源 基因启动报告基因表示突变存在，建立 随机插入突变体的胚胎干细胞库。 在整合位点利用靶基因调控原件模仿靶 基因表达报告基因，而终止靶基因自身 表达，阐明靶基因的功能。 诱捕载体本身无启动子，需借助内源基 因的调控元启动Neo和lacZ等报告基因。
ROSA转基因位点
终止序列stop
插入基因位点
鸡肌动蛋白与巨细胞病毒 增强子融合后的强启动子
东北师范大学
基因定向敲除
Gene targeted knockout
SEPT 通用筛选元件
东北师范大学
基因定向敲入
Gene targeted knockin
SEPT 通用筛选元件
东北师范大学
基因定向敲入
东北师范大学
Cre-LoxP重组酶系统
LoxP序列有两个13bp的反向重复序列和中间 间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同 时也确定了LoxP的方向。
5'-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3' 3'-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5'
东北师范大学
正向选择法
东北师范大学
负选择标记
negative selection marker
负选择标记基因在细胞内整合后，药 物转化型基因表达，使细胞能在相应 的抗性药物中死亡。即细胞在标记基 因转入后死亡。 使无毒药物变有毒。 如HSV-tk产物可转化GCV成细胞毒性 物质，导致细胞死亡。 HSV-tk编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶 GCV/GANC 更昔洛韦（抗疱疹药物）
东北师范大学
打了就走策略 (Hit and Run )
Hit
同源序列 采用插入型载体
打入突变基因
先行正向筛选 染色体内同源重组
Run
再行负向筛选 清除筛选标志
东北师范大学
打了就走策略 (Hit and Run )
插入型载体
同源序列
G418正向筛选
染色体内同源重组
同源序列 更昔洛韦负向筛选
清除筛选标志
基因打靶技术
东北师范大学
基因打靶技术
gene targeting
用含已知序列的基因片段与受体细 胞基因发生同源重组，定点改变某 一特定基因的技术手段。 建立在胚胎干细胞和同源重组技术 基础上，定向改变活体遗传信息， 分为胚胎干细胞和体细胞打靶两类。
东北师范大学
2007年诺贝尔生理学或医学奖获得者
东北师范大学
Cre-LoxP重组酶系统的特点
如果两个LoxP位点位于一条DNA链上， 且方向相同，Cre重组酶能有效切除 两个LoxP位点间的序列； 如果两个LoxP位点位于一条DNA链上， 但方向相反，Cre重组酶能导致两个 LoxP位点间的序列倒位； 如果两个LoxP位点分别位于两条不同 的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两 条DNA链的交换或易位。
东北师范大学
打了就走策略 (Hit and Run )
第一步Hit：在靶基因位点插入带有靶 基因组序列以及带有两个正负筛选标 记的载体骨架，先用正选择标记筛选。 第二步 Run 插入的重复序列会自发进 行染色体内重组，将载体序列、标记 基因及一个拷贝的同源序列切除，利 用负抗性筛选染色体内重组细胞。
Cre-LoxP重组酶系统
Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶 中获得广泛应用，是条件性基因打靶、 诱导性基因打靶、时空特异性基因打 来自噬菌体的限制性酶 靶策略的技术核心。
Cre 重组酶-DNA 复合体
LoxP是DNA上一段特殊序列
东北师范大学
Cre-LoxP重组酶系统
Cre重组酶：一种由343个氨基酸组成 的单体蛋白，它不仅具有催化活性， 而且与限制酶相似，能特异识别loxP 位点的DNA序列，使loxP位点间的基 因序列被删除或重组。 Cre重组酶工作时不需任何辅助因子。 同源重组后可完全去除标记基因,减 少不利影响。
发育到一定阶段 出现Cre活性
发育未到一定阶段 缺乏Cre活性
靶基因受影响
靶基因不受影响
东北师范大学
条件选择性基因敲除
Selective conditional knockout
Cre-LoxP与FLP-frt系统合用
东北师范大学
诱导性基因打靶
Inducible Gene Targeting
靶基因 基因置换 中靶
东北师范大学
典型的基因打靶载体构建
筛选标记
两侧同源序列
PCR
环化
转化
东北师范大学
正选择标记
Positive selection marker
正选择标记基因在细胞内整合后，抗药 性基因表达，使细胞能在相应的抗性药 物中存活。即细胞在标记基因转入后存 活。 使有毒药物变无毒。 如neo抗性基因对G418。即整合后使细胞 产生抗药性而存活。
东北师范大学
正向选择法
载体上有缺失自身调控因子的正向选择 基因，只能在整合后利用靶位点上相应 的表达调控元件启动表达。 例如去掉启动子和起始密码子。结果： 随机整合1—选择标记基因表达受阻 随机整合2—刚好整合在其它基因调控 元件部位，启动选择标记基因表达。 同源重组—重组位点正确，基因表达。 用酶切图谱或印迹杂交鉴定重组克隆。
东北师范大学
正负双向选择法
定点整合 细胞存活 阳性标记 阴性标记 同源区外区域被切除 细胞对正负药物均有抗性 随机整合 细胞死亡
整个载体插入
细胞死于负选择药物
东北师范大学
Hprt+/Hprt-正负双向选择系统
Mario Capecchi, Oliver Smithies
细胞内次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移 酶（hprt)常作为打靶基因报告基因。 正常细胞（Hprt+）能在HAT培养基中 生长，作为正向选择标志。利用补救途径 改造细胞（Hprt-）能在6-TG培养基中 生长，作为负向选择标志。弥补补救途径 HAT：次黄嘌呤,甲氨喋呤,胸腺嘧啶 6-TG: 6-巯基鸟嘌呤
常 用 干 扰 型 突 变
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基因插入型载体
gene-insertion vector
正向选择标记在同源序列外侧，重组 结果是整个载体整合到靶位点上，从 而干扰目标基因的功能。功能性删除。
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基因治疗型载体
Vector in gene therapy
载体上有取代基因，对基因突变而丧 失正常功能基因的纠正。
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组织特异性启动序列
两个LoxP之间含有 靶基因的转基因动物 含受控于组织特异性 启动子的Cre转基因动物
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组织特异性启动序列
Cre只在脑组织中表达
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条件性基因敲除
conditional knockout
Cre-LoxP与FLP-frt系统合用
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条件性基因打靶
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基因捕获载体
SD SA
克隆模板
报告基因提供剪接受体SA，与靶基因剪接供体 SD作用，产生靶基因上游与报告基因的融合转 录本，以此作为克隆突变基因序列的模板。
东北师范大学
启动子捕获载体
当载体插入到内源基因编码区 序列时报告基因才可能表达 。
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增强子捕获载体
含有启动子和翻译起始位点的载体整合到增 强子附近时，增强子可调控报告基因的表Leabharlann Baidu。
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Cre-LoxP的剪切、倒位、交换或易位
方向相同-切除
方向相反-倒位
如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或 染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或易位。
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Cre-LoxP的剪切与倒位机理
东北师范大学
Cre-LoxP的四种功能
东北师范大学
ROSA位点转基因小鼠
东北师范大学
基因置换型载体
gene-replacement vector
正向选择标记在同源序列内侧，重组 结果是载体上的同源序列取代靶序列。
东北师范大学
基因置换型载体
置换型载体线性化点位于同源序列外 侧，结果是载体同源序列取代靶序列。
常 用 于 敲 除 突 变
东北师范大学
基因插入型载体
插入型载体线性化点位于同源序列内 部，重组结果是整个载体插入到基因 组序列内部，干扰了目标基因的功能。
一种商品化的转基因小鼠。小鼠六号 染色体ROSA26基因是在所有组织中都 能编码一种非必需的核RNA。在该位 点进行基因嵌入建立的多用途的条件 性转基因小鼠模型，受到广泛重视。 由于动物与基因操作位点的统一，克 服了由于动物品系、整合位点及整合 效率不同等影响因素对试验结果及重 复性的影响。
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HAS-TK：产物能转化GCV而杀死细胞。 HAS-TK插入到载体的重组区外侧，同源 重组时TK丢失。随机整合时，整合部位 同时获得neo和HAS-tk两个基因，加入 GCV后细胞死亡。 未整合： neo-/tk-，细胞在G418中死亡。 随机整合：neo+/tk+，细胞在GCV中死亡。 同源重组：neo+/tk-，两种药物均存活。
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基因打靶技术
打靶载体的构建
胚 胎 干 细 胞 基 因 打 靶
囊胚注射 胚胎移植
筛选中靶细胞
F0 首建鼠
筛选动物及表型分析
回交
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同源重组
homologous recombination
发生在DNA同源序列之间或有相同或近似 碱基序列之间的遗传交换。要有重组酶 等一系列酶等的参与。(RecA)
一种人为控制转基因动物打靶时间的 基因打靶方式。 将Cre基因置于可诱导启动子控制下， 在任意时间通过诱导剂诱导表达Cre重 组酶，完成LoxP之间的基因操作。 将Cre基因受控于可诱导的组织特异性 启动子，加之诱导剂的精准注射，则 能更好地实现时空特异性基因打靶。
东北师范大学
标记基因定点突变筛选
靶细胞基因组存在负选择标记基因。 打靶载体有能插入负选择标记基因的同 源序列和正选择标记基因，导入受体细 胞后用两种药物进行筛选。结果如下： 未整合细胞在任一药物中全部死亡。 随机整合细胞在负选择性药物中死亡。 同源重组细胞在两种药物中均能存活。 因为同源重组造成细胞固有的负选择标 记基因失活。
（Mario Capecchi） (Oliver Smithies) （Martin John Evans） 东北师范大学
马丁·约翰·埃文斯
马里奥· 卡佩奇
奥利弗· 史密西斯
基因打靶技术的优点
位点精确度高：精确的定点修饰，克服 了随机插入对相邻序列的不良影响。 定量精确度高；拷贝数确定，避免了缺 乏量化概念的随机导入。 稳定性强：确保整合至染色体稳定遗传。 具有时空性：打靶效应具有发育特异性、 组织特异性和人为操控性。
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染色体内同源重组的结局
1
1
2
2
2 1
一个DNA分子上两个特异位点之间发生重组，会得到两种结果： 两个位点之间的片段被颠倒，两个位点之间的片段被丢失。
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双置换法( in and out)
in
第一次基因置换后正筛选
out
第二次基因置换后负筛选 除置换基因外不留无关序列
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东北师范大学
正负双向选择法
载体正向选择基因位于同源区内，随 机整合与同源重组时均表达。负选择 基因位于同源区之外，同源重组时被 切掉，而随机整合时被保留。
无整合: 细胞被正性选择药物杀死；
随机整合:细胞被负性选择药物杀死；
同源重组:对正性和负性药物均有抗性。
东北师范大学
neo/tk正负双向选择系统
采用来自酵母的FLP-frt系统
突变序列 置换序列
被置换序列
标记基因去除
东北师范大学
酵母FLP-frt系统
LoxP 与 FRT
东北师范大学
条件性基因打靶
Conditional gene targeting
一种针对转基因动物特定组织或发育 特定阶段的基因打靶方法。 基因打靶有时会严重影响胚胎发育， 由于是对整体细胞打靶，因此也很难 将成体表型归于哪类组织细胞，更难 排除由于发育缺陷引起的表型。 条件性基因打靶可以克服上述局限性。 动物1: Cre转基因动物。 动物2：两个LoxP之间含有靶基因的 转基因动物
姊妹染色单体交换 非 姊 妹 染 色 体 交 换
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DNA同源重组模型
Holliday junction Robin Holliday 1932-2014
Meselson-Radding, DSBR, SSA
东北师范大学
基因打靶的原理（敲除）
基因打靶载体 靶标
选择性标记
进入细胞核
两端同源序列重组
东北师范大学
基因治疗临床试验
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基因治疗临床试验
东北师范大学
基因捕获gene trap
将报告基因随机插入基因组，通过内源 基因启动报告基因表示突变存在，建立 随机插入突变体的胚胎干细胞库。 在整合位点利用靶基因调控原件模仿靶 基因表达报告基因，而终止靶基因自身 表达，阐明靶基因的功能。 诱捕载体本身无启动子，需借助内源基 因的调控元启动Neo和lacZ等报告基因。
ROSA转基因位点
终止序列stop
插入基因位点
鸡肌动蛋白与巨细胞病毒 增强子融合后的强启动子
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基因定向敲除
Gene targeted knockout
SEPT 通用筛选元件
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基因定向敲入
Gene targeted knockin
SEPT 通用筛选元件
东北师范大学
基因定向敲入
东北师范大学
Cre-LoxP重组酶系统
LoxP序列有两个13bp的反向重复序列和中间 间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同 时也确定了LoxP的方向。
5'-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3' 3'-TATTGAAGCATAT-TACATACG-ATATGCTTCAATA-5'
东北师范大学
正向选择法
东北师范大学
负选择标记
negative selection marker
负选择标记基因在细胞内整合后，药 物转化型基因表达，使细胞能在相应 的抗性药物中死亡。即细胞在标记基 因转入后死亡。 使无毒药物变有毒。 如HSV-tk产物可转化GCV成细胞毒性 物质，导致细胞死亡。 HSV-tk编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶 GCV/GANC 更昔洛韦（抗疱疹药物）
东北师范大学
打了就走策略 (Hit and Run )
Hit
同源序列 采用插入型载体
打入突变基因
先行正向筛选 染色体内同源重组
Run
再行负向筛选 清除筛选标志
东北师范大学
打了就走策略 (Hit and Run )
插入型载体
同源序列
G418正向筛选
染色体内同源重组
同源序列 更昔洛韦负向筛选
清除筛选标志
基因打靶技术
东北师范大学
基因打靶技术
gene targeting
用含已知序列的基因片段与受体细 胞基因发生同源重组，定点改变某 一特定基因的技术手段。 建立在胚胎干细胞和同源重组技术 基础上，定向改变活体遗传信息， 分为胚胎干细胞和体细胞打靶两类。
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2007年诺贝尔生理学或医学奖获得者
东北师范大学
Cre-LoxP重组酶系统的特点
如果两个LoxP位点位于一条DNA链上， 且方向相同，Cre重组酶能有效切除 两个LoxP位点间的序列； 如果两个LoxP位点位于一条DNA链上， 但方向相反，Cre重组酶能导致两个 LoxP位点间的序列倒位； 如果两个LoxP位点分别位于两条不同 的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两 条DNA链的交换或易位。
东北师范大学
打了就走策略 (Hit and Run )
第一步Hit：在靶基因位点插入带有靶 基因组序列以及带有两个正负筛选标 记的载体骨架，先用正选择标记筛选。 第二步 Run 插入的重复序列会自发进 行染色体内重组，将载体序列、标记 基因及一个拷贝的同源序列切除，利 用负抗性筛选染色体内重组细胞。
Cre-LoxP重组酶系统
Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶 中获得广泛应用，是条件性基因打靶、 诱导性基因打靶、时空特异性基因打 来自噬菌体的限制性酶 靶策略的技术核心。
Cre 重组酶-DNA 复合体
LoxP是DNA上一段特殊序列
东北师范大学
Cre-LoxP重组酶系统
Cre重组酶：一种由343个氨基酸组成 的单体蛋白，它不仅具有催化活性， 而且与限制酶相似，能特异识别loxP 位点的DNA序列，使loxP位点间的基 因序列被删除或重组。 Cre重组酶工作时不需任何辅助因子。 同源重组后可完全去除标记基因,减 少不利影响。
发育到一定阶段 出现Cre活性
发育未到一定阶段 缺乏Cre活性
靶基因受影响
靶基因不受影响
东北师范大学
条件选择性基因敲除
Selective conditional knockout
Cre-LoxP与FLP-frt系统合用
东北师范大学
诱导性基因打靶
Inducible Gene Targeting
靶基因 基因置换 中靶
东北师范大学
典型的基因打靶载体构建
筛选标记
两侧同源序列
PCR
环化
转化
东北师范大学
正选择标记
Positive selection marker
正选择标记基因在细胞内整合后，抗药 性基因表达，使细胞能在相应的抗性药 物中存活。即细胞在标记基因转入后存 活。 使有毒药物变无毒。 如neo抗性基因对G418。即整合后使细胞 产生抗药性而存活。