鱼类IL-21基因克隆、结构与组织表达分析

鱼类IL-21基因克隆、结构与组织表达分析1

项黎新，邵健忠

浙江大学生命科学院

E-mail：shaojz@

摘要：IL-21在天然免疫和获得性免疫中具有重要作用，鱼类中的相关报道很少。本文克隆了河豚IL-21基因（TnIL-21），该基因全长849 bp，5’UTR 69 bp，3’UTR 342 bp，ORF 438 bp，推导的IL-21多肽链含145个氨基酸，分子量16.5kDa。TnIL-21多肽链存在多个修饰位点和功能结构位点，包括3个N-糖基化位点、多个磷酸化位点、1个亮氨酸拉链结构以及1个由22个氨基酸组成的N端信号肽段。TnIL-21成熟肽具有4个α-螺旋结构，包含4个保守的半光氨酸残基（Cys61，Cys68，Cys110， Cys113）和1个谷氨酰胺残基（Gln133）。TnIL-21与其它7种已知的IL-21的氨基酸序列同源性较低，为20%~49%。TnIL-21具有组织表达特异性，仅在正常鱼的鳃、肠和性腺中有微量组成性表达；LPS刺激可提高相应的表达量，并同时诱导头肾和脾脏表达TnIL-21。比较河豚以及人类IL-21基因的上下游结构，证实了具有基因共线性，但河豚的基因构成相比于人类显得更为紧凑。

关键词：河豚基因组，TnIL-21，基因共线性，分子克隆，组织表达特异性

1. 前言

Interleukin-21 (IL-21)是近年来发现的一类新细胞因子，与 IL-2和IL-15具有同源性，含有4个IL-2家族特征的α螺旋结构，属IL-2超家族成员。IL-21由激活的CD4+辅助性T 细胞产生，初步的生物学功能研究显示，IL-21对T、B淋巴细胞，天然杀伤细胞和树突状细胞等都具有直接的调节效应，在调控体液和细胞免疫中发挥重要作用，因而受到广泛重视。目前，对IL-21的免疫生物学功能、受体及相关的信号通路研究主要集中在哺乳动物[1－29]，非哺乳动物中IL-21的研究很少。近年来，作者和Zhou等先后利用比较基因组学等方法，在红鳍东方豚中鉴定了IL-2和IL-21的同源基因，表明在生物进化中，IL-2细胞因子家族在鱼类中就已开始出现[30]。本文进一步报道黑青斑河豚IL-21基因克隆与鉴定，以期为深入开展鱼类IL-21的免疫生物学功能和IL-21的分子起源与进化研究提供科学依据。

2. 材料与方法

2.1 实验鱼

1龄黑青斑河豚（Tetraodon nigroviridis），体重4～6克，长4～5厘米，由本实验室保存。

2.2 TnIL-21基因鉴定

用人IL-21下游基因FGF-2和NUDT-6的氨基酸序列作为查询序列，对黑青斑河豚基因组数据库进行BLAST分析，找寻同源序列，然后用Genscan等程序对FGF-2上游序列进行预测，定位黑青斑河豚IL-21基因。

2.3 TnIL-21 cDNA克隆

背鳍皮下注射10µl （50 µg/ml）PHA，24小时后取肾和脾脏，提取RNA，方法参照Takara RNA Extraction Kit说明书。用1µg RNA作为模板，用3’ Full RACE Core Set试剂盒

1本课题得到教育部博士点基金资助项目（20030335040）的资助。

合成第一链cDNA，用引物IL21-F1和IL21-R1扩增中间片断，用3’ RACE与半套式PCR

扩增3’端序列，用5’ RACE扩增5’端序列，方法参照Takara RACE Core Set试剂盒说明书，

所用引物见表1。

表1. TnIL-21 cDNA克隆引物及序列

引物引物(5’－3’)

IL21-F1 GCTGGTGTTTTGCCTCTTTGC IL21-F2 GAGCTGGAAGGGGTGAACAAC IL21-F3 CAGGGAACTGCTGCTCACCAC IL21-F4 CCACGCCGCCAAAGAACAT

IL21-R1 TGTTTGGCAGGTTGCGTTTT

IL21-R2 CAGCGTGTTGTTCACCCCTTC IL21-R3 CTCCCTGCGAACCTCCTCTAG 3sites Adaptor Primer CTGATCTAGAGGTACCGGATCC

5’race primer pACAGCAGCCTTCCTC

β-actin-F ACACCTTCTACAATGAGCTG

β-actin-R CTGCTTGCTGATCCACATCT

2.4序列测定

克隆的cDNA用pUCm-T 克隆，用引物M13F和M13R筛选阳性克隆，由Invitrogen

公司测定序列。

2.5 TnIL-21 cDNA结构分析

用PROSITE数据库分析TnIL-21多肽序列的修饰位点，保守性结构域及其相应的生物

活性功能位点；用PHD软件预测二级结构；用SignalP分析信号肽；用Clustal W进行多序

列比对，构建进化树；用FRANSFAC 数据库分析启动子。

2.6TnIL-21的组织表达分析

将实验鱼分为诱导组和对照组，诱导组背鳍皮下注射诱导物（100µg LPS），24小时后

取头肾、脾脏、肠、心肌、脑、皮肤、肌肉、鳃和性腺等组织，对照组为未经诱导的正常鱼。

提取RNA，合成cDNA方法同前，以ß-actin为内参，进行半定量分析。PCR反应体系：buffer

（含Mg2＋）5µl；dNTP（各1mM）1µl；Taq酶 (5U/µl) 0.5µl；模板1µl；ß-actin-F（10µM）

1µl；ß-actin-R（10µM）1µl；IL21-F1（10µM）1µl；IL21-R1（10µM）1µl；蒸馏水补足到

℃秒，共30个循环；最后

℃秒，72 30

50µl。94℃预变性 4 分钟；随后94 30

℃秒, 56 30

72℃延伸10分钟。

2.7 TnIL-21基因结构分析

将克隆的TnIL-21 cDNA序列与TnIL-21基因组DNA序列（chr20: 2264765..2267600）

进行BLAST、GAP2分析，得到TnIL-21基因的外显子、内含子数目及大小。从NCBI

数据库中获取人类IL-21（Genbank accession no.AY763518）、小鼠IL-21（Genbank

accession no.AL645982）和红鳍东方豚IL-21（Genbank accession no.AJ584837）基因结

构信息，与TnIL-21基因作比较。用Genscan 和 BLAST对TnIL-21基因的上下游基因