DNA片断的酶切技术

DNA片断的酶切技术(2009-12-06 15:23:30)转载标签： 酶切重组dna粘端缓冲液连接酶于冰杂谈
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,这类酶的发现和应用促进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。该类酶是体外剪切基因片段的重要工具，基因物理图谱的绘制、核苷酸序列的测定、基因片段的重组，重组子的筛选、探针的制备及各种杂交、测量基因的拷贝数,基因文库构建,分子标记等都离不开限制性内切酶的应用。另外以限制性内切酶为基础的各种限制性内切酶片段长度多态性分析，促进了分子遗传学、分类学等相关学科的应用和发展。可以这么说，没有限制性内切酶的发现和应用就没有现代意义上的分子生物学、分子遗传学，也就不会有任何基因工程产品。而对于从事分子生物学或相关领域研究工作的人员讲来，如果不能很好地了解和掌握内切酶技术，那就根本不可能开展这方面的任何工作。

本部分实验主要通过EcoRⅠ，Hind III两种限制性内切酶对λDNA的单酶切、双酶切及部分酶切的操作，使学员能掌握内切酶的实验操作技术

一：仪器：

离心机 、 恒温水浴 、取液器、 电泳仪 、电泳槽、 紫外观测仪

二：试剂

EcoRⅠ,Hind Ⅲ,λDNA/HindⅢ及λDNA/EcoRⅠ 标准 质粒（或其他DNA样品）（浓度> 0.5μg/μl） TAE缓冲液

三：操作

(一)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ单酶切及双酶切

1, 取２支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入

Ａ(μl) B(μl)

灭菌水 １3 １3

EcoR Ⅰ缓冲液 ２

Hind Ⅲ缓冲液 ２

λDNA （或质粒DNA ） 4 4

EcoR Ⅰ １

Hind Ⅲ １

总体积 ２０ ２０

２，37℃保温１－4小时

3，保温结束后65-70℃10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提)

4，取2μl左右的反应液加入2μl电泳加样缓冲液，电泳

（二）EcoR Ⅰ、Hind III双酶切

1,取一支干净、灭菌Eppendof管，按下表加入各种试剂

加入试剂 体积（μl）

灭菌水 1２

MULT buffer 2

λDNA（或质粒DNA） 4

EcoR Ⅰ １

Hind Ⅲ １

总体积 2０

２，37℃保温１－２小时

３，保温结束后65-70℃10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提)

４，取2μl左右的反应液加入2μl电泳加样缓冲液，电泳

注意：１，样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒，

２，加酶步骤要在冰浴中进行，在
加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA

混匀

３，反应体积中水的量要尽量少，即反应体系的体积要尽量少，一般水解0.2-1ug模板DNA时，应将体积控制在20－30ul内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10,因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的，如加酶体积高于总体积的1/10,则反应液中甘油浓度将大于５％，而此浓度将抑制内切酶活性。

4，为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果，此时不得不增加反应体积；而一般为了增加DNA储藏的稳定性，DNA多保存在TE缓冲液中，如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高，而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。

5，本实验中双酶切时，因两种酶的缓冲液盐浓度要求相同，所以，可在同一反应体系中完成双酶切。但如进行双酶切时，两种酶所需缓冲液盐浓度要求不同，则不能将两种酶同时加入同一体系，进行反应，此时可采取下列处理办法

a:先用在低离子强度的缓冲液中活性最高的酶切割DNA，然后加入适量的NaCL及第二种酶，继续保温。

b:使用所有限制酶均可作用的单种缓冲液(谷氨酸钾缓冲液)。

C:一种酶水解完后，进行有机溶剂抽提，沉淀、干燥后再复溶然后进行第二种酶切。

在上述3种方法中遇到最多的可能为C

6，在水解结束灭活酶时可采用65℃加热10分钟或加EDTA至终浓度10mM，二者各有利弊，加热简单但对有些酶灭活不彻底。EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接反应变得极为困难，因此在连接前要求重新用有机溶剂抽提，这将增加操作难度和导致DNA的损失。

有关DNA限制性内切酶使用中的一些其他问题可参见附录。

实验六: 基因的重组连接技术

DNA酶切片段的连接是分子生物学实验中又一关键技术，该技术是基因重组，基因改造的重要中间环节。两DNA片段相邻的5'磷酸和3'羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA联接酶和T4DNA联接酶催化，但分子生物学实验中主要采用T4DNA联接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。在分子生物学实验中连接酶主要用于1)基因重组中载体与外源基因的连接；2) 接头与DNA片断的连接，这种连接一般发生在文库构建、分子标记的AFLP及差异表达的研究等中。连接反应可在溶液中进行也可在琼脂块中进行。本课程中在AFLP、文库构建、PCR片断的克隆等中均有连接的内容，在本部分仅以重组克隆为目的介绍相应的连接类型。在基因重组克隆中外源DNA与
载体的连

接是承上启下的一步操作，根据连接片断末端类型不同，连接方式有粘端连接、平端连接等和平粘端连接及单碱基配对的T－载体连接。其中粘端连接的效率最高，粘端连接与平粘连接中外源DNA片断在载体中的插入有方向性。平端连接的效率最低，且载体发生自连的比例较高，因此在克隆操作中为了克服平连的弊端，通常可通过1)TdT酶在载体和外源DNA片断上转移一互补序列（核苷酸投影法）；2)在载体和外源DNA片断上加上人工接头，变平连为粘连。下面拟通过T4DNA联接酶对酶切片段的连接操作，使学员掌握这一DNA片段的连接操作技术。

A：溶液中连接

一：仪器 离心机、恒温设备、真空干燥机、取液器

二：试剂

T4DNA联接酶

10×T4DNA联接酶缓冲液

200mM Tris-HCL (pH 7.6)、50mM MgCL2、5mM ATP、50mM DTT

500μg/ml ／牛血清白蛋白(可不用)

λDNA/HindIII 酚/氯仿、 酚、氯仿、TE缓冲液、电泳缓冲液、3M NaAC(pH 5.2)

三:操作：

1:取干净、灭菌Ephondof管，安下表加入各试液

T4DNA联接酶缓冲液 1ul

载体DNA片断 1ng

插入目的片断 Xng

连接酶 1u(平末端,如为粘端连接,则酶量可小于1u)

加无菌水到 10ul

X=目的片断与载体片断的分子比例×载体ng数×目的片断的碱基数/载体ng数

（目的片断/载体片断的分子比例一般为3/1）

2:连接反应

22℃保温3小时或4℃过夜(Promega连接酶,粘端连接)

或22-26℃1hr(BRL连接酶,粘端连接)

或22℃4-16hr(Promega连接酶,平端连接)

或14℃16-24hr(BRL连接酶)

B：胶内连接：该方法是一种快速克隆技术，将要重组连接的外源DNA片断用低熔点琼脂糖分离，在紫外灯下切下待克隆片断，溶化后加入缓冲液、载体DNA、连接酶直接连接。这种连接的待克隆片断既可以为酶切基因组片断也可为PCR片断，既可平连也可粘连，但连接效率较溶液中连接要低的多，但这种连接省去了待克隆片断的回收纯化操作。这种连接方法要求目的DNA量、载体量及酶量都要增加。

一：仪器：同A

二：试剂：同A

三：操作

1：低熔点琼脂糖胶分离外源DNA片断，在紫外灯下切下目的片断

2：65℃保温彻底溶化琼脂，取18ul（约0.1-0.5ug）于一新管内再加入2ul载体（约0.01-0.05ug）混匀，37℃5－10min

3：配制2×T4DNA连接酶反应体系20ul，（其中含2×T4DNA连接酶缓冲液和不低于2uT4DNA连接酶）混匀，点动离心后置于冰浴

4：将预冷的2×T4DNA联接酶反应体系20ul加到“2”中含待连接DNA样品管中立即混匀后立即置于冰浴中待凝固

5：置于12℃连接过夜。

6：此连接片断可直接用于转化，即转化前65℃

溶化，取5－10ul转化。

注1：粘端连接时模板DNA用量控制在0.1-0.5ug间，而平连时模板量应>0.5ug。拈连时温度可在4℃过夜，而平连时最好在12－16℃过夜

2：用于转化的连接片断最好不要冰冻

3：胶内连接时，应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解，将抑制连接酶。

4：在紫外光下观察切割条带时,操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。