形态观察方法

荧光屏成像
投影镜
电子显微镜的基本构造
主要电镜制样技术
超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图
负染色技术（Negative staining）重金属盐对铺展在载网上
样品染色，干燥后衬托出样品的精细结构
金属投影
冰冻蚀刻技术（Freeze etching） 颗粒和膜表面结构。
（技术示意图）
冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质 快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching） 电镜三维重构技术
香柏油R = 0.61*0.45μm / （1.5 *0.94）= 0.2μm
光镜分辨率的最小数值为0.2μm。
来自百度文库
R =0· 61λ /N.A 如何提高显微镜的分辨率？ 0.61 λ R＝ n· sinθ
高的分辨力（R值小）----波长， 镜口率。
n: 聚光镜和物镜之间
介质的折射率.
波长是定值（400nm~700nm），后者情况如何呢？ 空气为 1,油为1.5 N· A 也不能随意增大，一般在 0· 05~0· 95，用香柏油（油
Drosophila melanogaster
植株小 -15 cm 种子多- up to 10,000 seeds in a plant 周期短- 4 weeks for a cycle 基因组小 -5 chromosomes 140，000 kb（基因组测序完成）
Arabidopsis thaliana
三、扫描遂道显微镜 （ scanning tunneling
microscope ，STM）
原理：量子力学中的隧道效应，原子间作用力、磁力、摩擦力等 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据 采集、处理、显示系统。
特点：1、可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，分辨本领高
（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.001nm） 2、可在真空、大气、液体等多种条件下进行非破坏性测量 3、可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息 4、可连续成像，进行动态观察 用途：纳米生物学研究领域中的重要工具
激光作扫描光源 扫描焦平面上样品，得样品切面像
载物台上微量步进马达使载物台 上下移动,改变焦平面 得不同层次的切面图像
计算机图像三维重组获样品立体图像
"显微CT"
1953年诺贝尔物理奖
相差显微镜 （phase-contrast microscope）
细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不过人眼无法鉴别 这种微小的变化。相差显微镜能够把透过标本的可见光的光程差或
-5 -3
利用样本对光的吸收形 成明暗反差和颜色变化 玻璃透镜 不要求真空
利用样品对电子的散射和 透射形成明暗反差
光镜与电镜的主要区别
（1）光源不同 光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束
（2）透镜不同 光镜为玻璃；电镜为电磁透镜
（3）真空 （4）显示记录系统
电镜与光镜光路图比较
终像（眼或底片）
目镜 中间像 样品 物镜 聚光镜
相位差，变成振幅差，提高了各种结构间的对比度，使各 种结构变得清晰可见。可用于观察活细胞 。
在构造上，特殊:
1. 环形光阑(annular
diaphragm)：位于
光源与聚光器之间。 2. 相位板(annular phaseplate)： 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的 相位推迟1/4λ，将直射光与折射光分开。
原理 应用：
用激光作光源，排除焦平面以外光的干扰，逐点、 逐行、逐面快速扫描，增强图像反差。 能显示细胞样品的立体结构。 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 用途类似荧光显微镜，能扫描不同层次，形成
立体图像。
微分干涉显微镜
p51
（differential-interference microscope）
p63
步骤：
石 蜡 切 片 技 术
☆ 基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统
☆ 光学显微镜成像原理
保护眼睛
特点：1、光源为紫外线，波长
较短，分辨力高于普
通显微镜； 2、有两个特殊的滤光片；
照明方式常为落射式。
激发样本荧光
①天然物质经 紫外线照射后 发荧光的物质， 如叶绿素能发 出血红色荧光。
1.25-1.4 1.8-2.0 mm 0.1 mm 0.18 m
光）时的分辨率
人眼的分辨能力在0.2 mm左右，因此光学显微镜的 最大有效放大倍数（使用油镜）是1,000×到1,400×。
2 分辨力/率（resdving power）：R， 指25cm明视距离处， 能分辨清楚尽可能靠近的两个质点的能力。辨认两点之间 的距离越小，则分辨本领愈高。人裸眼的分辨力约为
通过致密部分(如细胞核),速度慢 通过疏松部位(如细胞质),速度快
相差显微镜 相位差 (光程差)
振幅差 (明暗差)
样品 液态氟利昂
快速冷冻 液氮 低温断裂 低温刀
刀锋 断裂示意图 升华 蚀刻 复型 收集复型膜于载网 蚀刻 用金属和碳喷镀，消化样品 样品 碳 铂
上，置电镜下观察
• 20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。
• 分辨力为6～10nm，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最 近两个光点的能力）为0.2mm，扫描电镜的有效放大倍率为
0.2mm/10nm=20000X。
扫描电镜工作原理：
电子枪→电子束（φ 20~30 μm）→第一、二聚光镜→物镜（汇聚作 用）→电子探针（φ 几十埃）→在样品表面扫描，激发出多种电子信 号（次级电子，电压信号）→检测器（捕获信号，经放大、转换）→
镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线，与物镜前 透镜有效直径的边缘所张的角度。 α角小于 180°， α/2 小于90°，sinα/ 2 最大值不超过 1，因
此N· A不会超过1。目前最好的显微镜α=140 °
一般的显微镜上标明10× /0.65、0.75、0.8等，就是指数值孔 径，其大小代表了光镜汇聚光线的能力，α大，张角大，光通 过的多、亮，透性好清晰
1.
普通光学显微镜 玻 璃 透 镜 的 工 作 原 理
原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。
1 数值孔径（镜口率）NA：指光镜的汇聚能力，
N.A = n · sinα/2
注： α--镜口角， n--介质折射率。
空气--1、水--1· 33、香柏油--1· 515、溴萘--1· 6
二、电子显微镜技术 electron microscopy
电子显微镜的基本知识
主要电镜制样技术
扫描电镜
电镜与光镜的比较
电镜与光镜光路图比较
电子显微镜的基本构造
1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜。 直到1965年，才有英国剑桥科学仪器有限公司生产出实用 性强的商品扫描电镜。由于扫描电镜具有显著的优点，广泛 应用于生物学、医学、古生物学、地质学、化学、物理学、 电子学以及勘察、冶金，机械与轻工业等领域，成为十分有 用的研究工具。
荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）
原理与应用
直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于观察能激发出荧光的结构。免疫 荧光观察、疾病诊断、特异蛋白质等生物大分子 的定性定位：如绿色荧光蛋白(GFP)的应用
激光共焦扫描显微镜技术
（Laser Confocal Microscopy）
紫外线为光源，照射 被检物体发出荧光，在 显微镜下观察形状及所 在位置。 首先汞灯发出紫外线，
经第一次滤光片除去较
长的波，使紫外线照到 样品上。目镜下方滤光
片除去紫外线，使可见
光通过，以保护眼睛。
•电子显微镜原理
•以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并 且波长与加速电压(通常50-120KV)的平方根成反比。 • 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录 系统、电源系统等5部分构成。 • 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 • 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2µm、 光学显微镜下无法看清的结构， 又称亚显微结构 （submicroscopic structures）。
θ: 标本对物镜镜口 镜）可达 1· 5，用溴萘可近1· 6。这样，光镜的最大分辨力R= 张角的半角 . 6=209（nm）（约为可见光最短波长的一 （0 61 × 550 ） /1 · · sinθ的最大值为1 半）。 λ:照明光源的波长.
所以，R=0· 2μm是光镜的极限，显微镜无论制作的如何 白光为0.5 μm 精密，都无法突破这一极限。
整装细胞电镜技术 是观察细胞骨架的处理技术。
扫描电镜
（Scanning electron microscope，SEM）
原理与应用： 电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测 器收集二次电子成象。 特点： 引起样品变形的表面张力问题--- CO 2临界点干燥法
核酸大分子制样技术 电镜显微放射自显影 电镜整装细胞制片技术
100μm，（实际上200μm才是理想的）。而显微镜分辨力
则以下公式计算： R =0· 61λ /N.A λ-光源的波长
可见光波长λ=0.45μm， α/2=70°， sinα/2=0.94 空气折射率n=1，香柏油n=1.5 空气 R = 0.61 λ/N.A =0.61*0.45μm / （1 *0.94）=0.3μm
离有函数关系，将扫 描过程中电流的变化
转换为图像，从而反
映出样品表面形貌信 息、电特性或磁特性 等。
电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重
要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及
核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学。 ——是研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。
第三章 细胞生物学研究方法
进行初步观察 形成可验证的假说 设计对照试验 查阅已 有知识
收集资料
解释结果 生物学研究模式生物
作出合理结论
第三章 细胞生物学研究方法
细胞形态结构的观察方法
光学显微镜技术
细胞组分的分析方法
电子显微镜技术 扫描遂道显微镜
细胞培养、细胞工程与显微操作技术
光学显微镜物镜的特性
物镜 特性 放大倍数 数值孔径值 焦距（ f） 工作距离
450nm 光源（蓝 搜索物镜 4× 0.10 40 mm 17-20 mm 2.3 m 低倍镜
10×
高倍镜 40-45× 0.55-0.65 4 mm 0.5-0.7 mm 0.35 m
油镜
90-100×
0.25 16 mm 4-8 mm 0.9 m
最大放大倍数
3 放大倍数/率（magnification）：M 是最终成像的大小 与原物体大小的比值（指长度）
目镜放大倍数MF目= 250mm （明视距离）/F目（目镜焦距）
偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转 化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。 适于研究活细胞中较大的细胞器
录像增差显微镜技术
（video-enhance microscopy）
计算机辅助的微分干涉显微镜可在高分辨率下
研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动
电子显微镜与光学显微镜的基本区别
分辨本领 人眼 光学显微镜 0.2mm 200nm 光 源 透 镜 真 空 成像原理 可见光 可见光 (波长 400～700nm) 100nm 紫外光 （波长约 200nm） 电子显微镜 接近 0.1nm 电子束 (波长 0.01～0.9nm) 电磁透镜 1.33×10 ～ 1.33×10 Pa
电压信号→调制显象管亮度→显示图像→照相记录。
• 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷 涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。
原理：扫描探针与样品 接触或达到很近距离
时，即产生彼此间相
互作用力，电流强度 与针尖和样品间的距
如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用 力、磁力、摩擦力等，
一、光学显微镜技术light microscopy
普通复式光学显微镜技术
荧光显微镜技术 相差显微镜 微分干涉显微镜 p53 重要的光学技术参数 光镜样本制作 激光共焦扫描显微镜技术 p53 p51 p51
录像增差显微镜技术
倒置显微镜 暗视野显微镜 显微镜发展趋势 采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野 DIC、摄影装置于一体。自动化与电子化。