蛋白质类药物的分离纯

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电泳过程示意图
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A. 聚丙烯酰胺凝胶电泳
（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）
以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。
聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，有弹性，透明，
化学性质稳定，对pH和温度变化小，吸附和
电渗作用小，是很好的电泳支持介质。
蛋白质分子量很大，分子粒径为1～100nm，
属亲水胶体在水中能形成稳定胶体溶液。蛋白质
分子表面的水化膜和表面电荷是稳定亲水溶胶的
两个重要因素。
-
-
+
+ + +
--
+
-
-
--
+- - + - +
-+
-
-
+
+
+
- - 医学PPT
-
-
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③ 蛋白质的沉淀
• 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所 带的电荷和水化作用有关。
• 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 • 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来
蛋白质沉淀——
蛋白质的肽链相互聚集，从溶液中析出。
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蛋白质胶体颗粒的沉淀
+ ++ + + ++
---
-
-
- --
（疏水胶体）
（沉淀）
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（疏水胶体）
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蛋白质的非变性沉淀
● 沉淀过程中，蛋白质结构和性质都不发生变化，
F引 EQ
溶液中，运动粒子与溶液之间存在阻力F阻：
F阻6rV
当F引=F阻时： EQ6rV
EQ
V
6 r 医学PPT
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V EQ
6r
● 粒子泳动速度V与场强E、粒子电量Q成正比；
● V与粒子半径r、溶液粘度η成反比； ● V与粒子形状有关。
非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到 更大的阻力。
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决定离子交换种类及条件 选择不同孔径的介质 与疏水、反相介质结合的程
决定亲和配基 决定分离体系及蛋白浓度 决定医工学PP艺T 采用温度及流程时4
① 两性解离与等电点
蛋白质分子中存在游离氨基和羧基，具有两 性解离性质。
当蛋白质溶液处于某pH时，蛋白质分子解离 成正、负离子的趋势相等，净电荷为零，此时溶 液pH称为蛋白质的等电点pI。
四.生物药物的制备 3.蛋白质类药物的分离纯化方法
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生产过程
上游构建 （基因工程）
发酵生产 (发酵工程)
纯化制备
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蛋白质的分离纯化
● 来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞； ● 分离和纯化过程都必须在温和条件下进行。
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1）蛋白质的基本特性
产物特性
作用
等电点 相对分子量 疏水性 度 生物特异性 溶解性 稳定性
层析
分子筛
超速离心
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① 盐析（Salting out)
定 义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。
原 理：破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层。 中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。 优 点：Pr不变性，常用。
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② 电泳（electrophoresis)
N3 H +
O-H
N3 H +
O-H
N2 H
Pr COOH H+
Pr CO - O H+
Pr CO - O
阳 离 子 pH <pI
兼 性 离 子 p 医H 学P=Pp TI
阴 离 子 pH >pI 5
利用蛋白质两性电离的性质，可通过电 泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋 白质。
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② 蛋白质的胶体性质
丙烯酰胺——单体 N，N’-甲叉双丙烯酰胺——交联剂
催化合成
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CH2=CH C=O NH2
丙烯酰胺
CH2-CH (CH2¯ CH )n CH2-CH( CH2-CH )mCH2-CH
C=O
C=O C=O
NH2
NH CH2
NH2
NH
C=O
CH2-CH ( CH2-CH )nCH2-CH( CH2-CH )mCH2-CH
定义：带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相
反方向泳动的现象叫电泳。
原理：
● Pr分子在溶液中可带净负电荷或净正电荷，可 在电场中移动。
● 不 同 Pr 分 子 携 带 电 荷 量 不 同 ， 分 子 大 小 也
不同，故在电场中泳动速度不同，可彼此分离。
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电场中，带净电荷Q的粒子所受电荷引力：
Tris-Gly pH=8.3
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Tris-HCl pH=8.9 T=7.5%
Tris-Gly pH=8.3
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板状电泳
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B. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳
当电泳体系含有十二烷基硫酸钠（SDS）时,电泳 迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，可直接 由电泳迁移率计算蛋白质分子量。
在适当条件下，可以重新溶解形成溶液。
● 是分离、纯化蛋白质的基本方法。如：等电点
沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法等。
● 去除变性因素后，恢复原有空间构象和生物活
性。
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核糖核酸酶可逆变性
尿素或 2-巯基乙醇
天然状态， 有催化活性
去除 变性因素
非折叠状态， 无活性， 二硫键被还原
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天然状态， 二硫键恢复， 11 而且正确配对
蛋白质的变性沉淀
•在强烈沉淀条件下，蛋白质胶体溶液的稳定性、 蛋白质分子结构和性质均被破坏，沉淀不能重新 溶解于水。
•由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变 化，所以是变性沉淀。
•加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物
碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
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2）蛋白质的分离纯化方法
盐析
电泳
透析
凝胶pH不同
电极缓冲液——pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液；
浓缩胶——pH6.8的Tris-HCl缓冲液；
分离胶——pH8.9 的Tris-HCl缓冲液；
三种物理效应——样品浓缩效应，凝胶分子筛效应，
电荷效应。
——分离效医果学PP好T ，分辨率高。
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Tris-HCl pH=6.8 T=3%
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SDS的作用原理
• 阴离子SDS能与蛋白质结合。 • 当SDS总量为蛋白量的3～10倍、且SDS单位
浓度大于1mol./L时，两者的结合是定量的， 每克蛋白质约结合1.4克SDS。 • 蛋白质分子结合SDS后，所带负电荷的量远远 超过其原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白 质间电荷负荷的差异。
C=O
C=O
NH2
NH2
聚丙烯酰胺
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CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O
CH2=CH
N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
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常规聚丙烯酰胺凝胶电泳主要特点
凝胶由上、下两层凝胶组成
上层——大孔径浓缩胶，浓度2～3％；
下层——小孔径分离胶，浓度5～15％；
缓冲液ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ主要阴离子——Gly-, Cl-；