土壤酶活性测定方法

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

二、试剂

1）甲苯

2）10% 尿素：称取 10g 尿素，用水溶至 100ml 。

3 ）柠檬酸盐缓冲液（ PH6.7 ）：184g 柠檬酸和 147.5g 氢氧化钾（ KOH ）溶于蒸馏水。将

两溶液合并，用 1mol/LNaOH 将 PH 调至 6.7 ，用水稀释定容至 1000ml 。

4 ）苯酚钠溶液（ 1.35mol/L ）：62.5g 苯酚溶于少量乙醇，加 2ml 甲醇和 18.5ml 丙酮，用

乙醇稀释至100ml （ A液），存于冰箱中；27gNaOH 溶于100ml水（B液）。将A、B

溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至 100ml 。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9% ，溶液稳定。

6 ）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至 1000ml ，得到1ml含有0.1mg 氮的标

准液；再将此液稀释 10 倍（吸取 10ml 标准液定容至 100ml ）制成氮的工作液

（0.01mg/ml ）。

三、操作步骤

称取 5g 土样于 50ml 三角瓶中，加 1ml 甲苯，振荡均匀， 15min 后加 10ml10% 尿素溶液和20ml PH 6.7 柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37 C恒温箱培养24小时。培养结束后

过滤，过滤后取 1ml 滤液加入 50ml 容量瓶中，再加 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，随加随摇匀。 20min 后显色，定容。 1h 内在分光光度计与 578nm 波长处比色。（靛酚的蓝色在 1h 内保持稳定）。

标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取 0、 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13ml 氮工作液，移于 50ml 容量瓶中，然后补加蒸馏水至 20ml 。再加入 4ml 苯酚钠溶液和 3ml 次氯酸钠溶液，随加随摇匀。 20min 后显色，定容。 1h 内在分光光度计上于 578nm 波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

注意事项 :

1 、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品

实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。

2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质

自身分解。

3、如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样

四、结果计算：以 24 小时后 1g 土壤中 NH 3－N 的毫克数表示土壤脲酶活性( Ure )。

Ure= (a样品一a无土一 a无基质)x V x n/ m

式中： a 样品为样品吸光值由标准曲线求得的 NH 3－N 毫克数；

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3 — N毫克数；

a 无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH 3－N 毫克数；

V 为显色液体积； n 为分取倍数，浸出液体积/吸取滤液体积； m 表示烘干土重

土壤磷酸酶活性测定(磷酸苯二钠比色法)

一、原理

测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通常称为有

有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。研究证明：磷酸酶有三种最适 PH 值： 4~5 、 6~7 、8~10 。因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的 PH 缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常用的 PH 缓冲体系有乙酸盐缓冲液( PH5.0~5.4 )、柠檬酸盐缓冲液( PH7.0 )、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(PH7.0~8.5 )、和硼酸缓冲液(PH9~10 )。磷酸酶测定时常用基质有磷酸苯二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、a-或者仆萘酚磷酸钠等。现介绍磷酸苯二钠比色法。

二、试剂

1 )缓冲液：

( 1 )醋酸盐缓冲液( PH 5.0 )

0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至 1L.

0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C 2H3O2W 或 27g C 2H3O2Na.3H 2O 溶至 1L.

取 14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和 35.2ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液稀释至 1L.

( 2)柠檬酸盐缓冲液( PH 7.0 )

0.1mol/L 柠檬酸溶液 19.2g C 6H7O8 溶至 1L.

0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 53.63g Na 2HPO 4.7H 2O 或者 71.7g Na 2HPO 4.12H 2O 溶至1L.

取 6.4ml 0.1mol/L 柠檬酸溶液加 43.6ml 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液稀释至 100ml.

（3）硼酸盐缓冲液（ PH 9.6 ）

0.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至 1L.

0.2mol/L NaOH 溶液 8g NaOH 溶至 1L.

取 50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加 23ml 0.2mol/L NaOH 溶液稀释至 200ml.

2）0.5% 磷酸苯二钠（用缓冲液配制）

3）氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取0.125g 氯代二溴对苯醌亚胺，用 10ml 96% 乙醇溶解，

贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。

4）甲苯

5）0.3% 硫酸铝溶液

6）酚标准溶液

酚原液：取 1g 重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L ，存于棕色瓶中。

酚工作液（ 0.01mg/ml ）：取 10ml 酚原液稀释至 1L 。

三、操作步骤

称 5g 土样置于 200ml 三角瓶中，加 2.5ml 甲苯，轻摇 15min 后，加入 20ml 0.5% 磷酸苯二