淋巴细胞抗原受体

3、类别转换(同种型转换)
在抗体应答过程中，B细胞激活后分泌Ig 的类别发生转换。
类别转换主要与同一V区基因与不同重链 C区基因重排有关。
表 达 CH 的 基因片段有 9个，除了 Cδ 以 外 ， 它们之前都
有一个 DNA 序 列 重复排列的
转换区，如
要转换某一
类别，其上 游的C基因 片段即被环 出。
二、IgM
1.五聚体，分子量最大(900 kd)，又称巨球蛋白；
2.人类发育过程中最早合成的Ig；
3.体液免疫应答最先产生的 Ig — 感染早期免疫；
4.占血清Ig含量的5～10%；
5.半衰期 5天 — 血清中特异性IgM 水平增高提示
有近期感染；
J Fra Baidu bibliotekhain
6.激活补体；
7.IgM 不能通过胎盘 →脐带血或新生儿血清中IgM
研究证明：
不同的V基因实际上是由少数原先分 隔的胚系基因片段，在淋巴细胞发生分化 过程中，通过重排(组合、拼接及高频突变 等)的过程，从而获得了特异性的V基因， 产生巨大数量特异的抗原受体以识别不同 的抗原，BCR的多样性可达1014，TCR的 多样性可达1016。
一、BCR、TCR基因结构及其重排
二、多样性产生的机制
1、组合造成的多样性
2、连接造成的多样性
CDR3区位于V、J和V、D、J片段连 接处，可丢失或加入数个核苷酸(N插入)， 在末端脱氧核苷酸转移酶作用下，不需 模板，直接加入核苷酸至DNA断端，在 V-D-J之间，形成VNDNJ ，而显著增加 了CDR3的多样性
3、体细胞高频突变造成的多样性
可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂
目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的 免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原 颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原 性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗 原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应 答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提 供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血 清中抗体效价不一定最高。
可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完全 佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免疫 （量减半，改用不完全佐剂，可反复多 次） 冲击免疫（融合前3天进行）
选用6-12周龄Balb/c小鼠
颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很 好的免疫效果
Tail Piece
五、IgE
1.单体分子； 2.血清中含量最低(占Ig的0.002%)； 3.半衰期 3天； 4.呼吸道和胃肠道浆细胞产生； 5.介导Ⅰ型超敏反应； 6.过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异
性IgE水平增高。
C4
第七节 单克隆抗体和基因工程抗体
一、多克隆抗体(polyclonal antibody) 1.定义 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物
2.介导免疫细胞活性 (1)调理作用(opsonization)：IgG + 抗原(颗粒性) → FcγR（单核、巨噬细胞及中性粒细胞） → 促吞噬细胞吞噬； (2)ADCC：IgG + 抗原(靶细胞) → Fc γR（NK 细胞）→ 杀伤靶细胞；
(3)介导超敏反应：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应。
3.穿越胎盘和粘膜
4、BCR(膜型Ig)和分泌型Ig
在转录时如只转录到SC(分泌性外显子)， 不能表达疏水性氨基酸残基，只能分泌 出去。 如继续转录至MC(膜性外显子)，则可 表达疏水性的跨膜区和膜内区，插入细 胞膜，作为膜受体。
在转录时如只 转录到SC(分 泌性外显子)， 不能表达疏水 性氨基酸残基， 只能分泌出去。 如继续转录至 MC(膜性外显 子)，则可表达 疏水性的跨膜 区和膜内区， 插入细胞膜， 作为膜受体。
细胞融合
HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞
检测筛选阳性细胞
克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）
McAb 纯化及鉴定
制备单克隆抗体的基本技术
1 抗原提纯与动物免疫 2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合 4 抗体检测 5 杂交瘤的克隆化和冻存 6 McAB的制备 7 单克隆抗体的纯化
骨髓瘤细胞 — 无限增殖； 免疫B细胞 — 合成、分泌特异性抗体。 4.杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H), 氨基蝶呤(A)和胸腺嘧 啶核苷(T)。
杂交瘤技术的理论基础
淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即 一种克隆只产生一种抗体
细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保 持双方亲代细胞的特性
利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞， 并克隆化，制备McAb
BCR/Ig的重链V区基因 是由三 种胚系基因片段：V、D、J拼接 而成，轻链V区基因 是由V、J 两个基因片段拼接成的。互补决 定区CDR1+CDR2←V基因片段， 大部CDR3←D， 其余CDR3←J 。
BACK
C区的基因在V区基因的下游，1~9个， 如H的C基因有9个功能性基因。
TCR的β、δ链是由三种胚系基因片段：V、 D、J 拼接而成，α、γ链基因是由V、J 两 个基因片段拼接成的。
尿核苷单磷酸
胸腺嘧啶核苷酸
TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）
HAT选择培养基的原理
HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)
抗原免疫的脾细胞
（B细胞） 1. 抗体分泌（Ig+)
在HAT生长
第六节 各类免疫球蛋白的特性和功能
一、IgG
1.一般特性
(1)单体分子；
IgG1, IgG2 and IgG4
IgG3
(2)四个亚类；
(3)血清中含量最高(75%Ig)；
(4)半衰期最长(21～23天)；
(5)3～5岁达成人水平(8.0～17 mg/ml)；
(6)可与SPA结合。
2.生物学活性 (1)通过胎盘（新生儿抗感染）； (2)激活补体（裂解细胞）； (3)调理作用（促进吞噬）； (4)介导ADCC（细胞毒作用）。 3.实际意义 (1)抗感染； (2)自身抗体 → 自身免疫病； (3)介导变态反应(Ⅱ、Ⅲ型)； (4)封闭抗体 → 肿瘤细胞逃逸； (5)亲合层析法 — IgG纯化； (6)免疫学检测。
V、D、J片段各有多个 一个淋巴细胞中只有一个片段参与组成 抗原受体V区的编码基因
14号染色体中 7号染色体q 7号染色体p
TCR的β、δ链 是由三种胚系 基因片段：V、 D、J 拼接而成， α、γ链基因是 由V、J 两个基 因片段拼接成 的。
BACK
二、基因重排：
1、重组酶：重组激活酶、末端脱氧核酸 转移酶、DNA外切酶、DNA合成酶等。
小鼠骨髓瘤细胞
（B细胞恶性肿瘤） 1.具永生性 2.HGPRT+ 2.8-AG筛选出
HGPRT-株
PEG 融合 HAT筛选
脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+）
融合的结果及命运
未融合的骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
脾-脾杂交细胞
未融合的脾细胞
骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞
免疫动物
培养骨髓瘤细胞
收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞
5.聚合IgA激活补体替代途径。
Secretory Piece
J Chain
Origin of Secretory Component of sIgA
四、IgD
1.单体分子 2.存在形式 分泌型 — 血清中，功能不清；
膜结合型 — B细胞表面, 3.意义
（1）是B细胞成熟的重要标志； （2）抗原受体； 4.占血清Ig含量的1%； 5.半衰期 3天。
克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。 目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细 胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分 泌细胞分开。
质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如: 免疫血清（含多种特异性抗体）。 2.实际意义 （1）预防、治疗感染性疾病
（2）临床诊断
二、单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)
1.定义 由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗 原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。
2.特点 具有高度均一性。 3.杂交瘤细胞
第五节 抗体的功能
一、 V区的功能 — 识别并特异性结合抗原
1.抗体的结合价
单体(IgG, IgE) — 2价 二聚体(分泌型IgA) — 4价 五聚体(IgM) — 10价（5价）
中和效应 — 中和毒素和病毒 2.实际意义 与Ag结合 — 促吞噬细胞吞噬
二、 C区的功能
1.激活补体系统 Ab(IgM、IgG) + Ag → C1q → 补体经典途径 IgG4、IgA的凝聚物 → 补体旁路途径
骨髓瘤细胞系选择要点：
稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、 HGPRT缺陷株
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）
防止支原体污染（胎牛血清）
融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好 的形态，活细胞计数高于95％
融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节 需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克 隆化和扩大培养过程中
2、等位排斥和同种型排斥 (1) 等位排斥：
在一对同源染色体的某一基因座位上， 二条染色体的等位基因中只有一个基 因能表达。保证了一个B细胞或T细胞 只能表达一种特异性的抗原受体。
(2) 同种型排斥：
表达同一类型肽链的不同基因座位之间 的排斥。如表达L链的κ链基因在第2号染 色体上，而λ链基因在第22号染色体上， 在一个细胞内它们不能同时表达，只能 表达其中之一，κ/λ，κ：λ=65：35。
克隆选择学说：Burnet(澳) 1957年
①免疫细胞随机形成多样性的细胞系(克 隆,Clone),每一克隆细胞表达同一种特异的识别 抗原受体，识别相同抗原。
②胚胎期的免疫细胞系接触抗原后，该细 胞系被排除或失去活性，处于抑制状态，成为 禁忌克隆，产生耐受。
③成熟淋巴细胞可识别外来抗原，被选择 而活化、产生效应。
常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞
饲养细胞一般在融合前一天制备
免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴 母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强 免疫3天后的脾脏。
融合比例：
骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10
融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）
融合24小时后加HAT培养液 2周后 改 用HT培养液 2周后 改用一般培养液
（一）胚系基因结构：
肽链编码基因： 编码V区的基因， V区基因的下游是： 编码C区的基因
重链V区基因由基因片段：V、D、J拼接 轻链V区基因由V、J基因片段拼接 互补决定区CDR1+CDR2←V基因片段，
大部CDR3←D， 其余CDR3←J 。
14号染色体 2号染色体 22号染色体
C区的基因在V区基因的下游，1~9 个，如H的C基因有9个功能性基因。
水平升高表明胎儿有宫内感染；
8.B细胞膜IgM(mIgM) →体液免疫应答；
C4
9.自身抗体 → 自身免疫病
三、IgA
1.两种类型
血清型： IgA1，单体；
分泌型：IgA2，二聚体, 粘膜局部浆细胞合成； 分泌片由粘膜上皮细胞合成；
2.半衰期 6天； 3.占血清Ig含量的5～15%； 4.粘膜局部抗感染免疫；
外周淋巴组织生发中心内的成熟B细胞， 在受到抗原剌激后，已重排好的V区基因 (尤CDR3)突变频率增高，称体细胞高频 突变，主要为点突变，非随机性。抗原 对多株高频突变细胞的选择结果，使其 表达的的IgV区CDR(互补决定区)与抗原 表位的互补性更优于原先分子，即为抗 体的亲和力成熟。
三、淋巴细胞的克隆选择
当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融 合在一起。融合细胞含有两个不同的细 胞核，称为异核体，产生具有原来两个 细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交 细胞（hybrid cell）。
细胞DNA合成途经
1.替代途径：次黄嘌呤（H）
2.主要途径： 氨基 酸
HGPRT 鸟嘌呤核苷酸
谷 氨 酰 胺 （A-）
抗体
第四节 淋巴细胞抗原识别受体的 编码基因及多样性的产生
n(抗原表位) ↑↓
n(T/B细胞克隆) ← n(TCR/BCR) ← n(V基因)
机体存在着特异性识别各种抗原的T、B细胞 克隆，称T、B细胞库, 即TCR、BCR的多样性
一个机体每一个淋巴细胞是不是具有 这么巨大数量的V基因库呢？ 没有。