激光共聚焦扫描显微镜技术

激光共聚焦扫描显微镜技术
一、简介
激光共聚焦扫描显微镜在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非焦平面及焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清晰度。

在此基础上，由于计算机及相应的软件技术组合，可以对较厚样品进行连续光学切片及三维重建。

目前，激光共聚焦显微镜（LSCM）技术已广泛应用于生物医学领域。

本文对LSCM的应用原理、较普通光镜的优点及生物学应用做简单介绍。

激光共聚焦扫描显微镜是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。

其组成除光学显微镜部分之外主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集，处理，转换，应用软件）、图象输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。

在生物医学等研究领域中发挥重要作用，尤其在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维重建等方面，是传统的光学显微镜所望尘莫及的。

二、 L SCM的主要组成部分及工作原理：
illuminating pinhole:照明针孔
功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。

且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。

beamsplitter:光束分离器
功能：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。

Objective:物镜
Focal plane:焦平面
功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。

该光斑经过objective,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole及detector pinhole两处聚焦。

共聚焦的含义由此而来。

detector pinhole:探测器针孔
功能：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。

最大限度的阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于
样品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共轭）。

PMT：光电倍增管（探测器）
功能：接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平面的图象。

激光器：图中未示。

共聚焦显微镜技术的发展离不开激光器的飞速发展。

我们可以根据研究需要选择不同的激光器。

如：
ArUV(351.364nm),HeCd(442nm),AR(457,488,514nm),ArKr(488,568,647nm)Kr(568nm),HeNe(5 43nm),HeNe(633nm)等。

多荧光通道：具有多个荧光通道，以实现同时对样品进行多种标记。

经过对LSCM的各组成部分了解之后，其工作原理不难理解。

即：点光源照射样品产生的激发光斑被探测器以共扼的形式接收于焦平面，计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上。

为产生一幅完整图象，可通过计算机控制的步动电动机带动显微镜移动，以实现在同一焦平面上的逐点扫描。

同样，也可以通过沿Z轴方向逐渐改变焦平面，来完成对样品不同层面的扫描。

亦即可对细胞或组织厚片进行类似CT断层扫描的无损伤连续光学切片，连续光学切片经过计算机三维重建的处理，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构。

三、 L SCM相对光学显微镜的优点
（1）LSCM的图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图象处理；
（2）LSCM利用共聚焦系统有效的排除了焦点以外的光信号干扰，提高了分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间定位；
（3）由于LSCM能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径；
（4）LSCM除具有成像功能外，还有图象处理功能和细胞生物学功能，前者包括光学切片、三维图象重建、细胞物理和生物学测定、荧光定量、定位分析以及离子的实时定量测定；后者包括黏附细胞的分选、激光细胞纤维外科及光陷阱技术、荧光漂白后恢复技术等。

四、主要技术指标
1）、xy分辨率：Rxy=0.4波长/数值孔径，是传统显微镜Rxy(0.61波长/数值孔径)的1.4倍，但比起透射电子显微镜0.1nm的分辨率仍低很多，它是连接这两种常规技术的中间桥梁（11）。

2）待测样品最大厚度：约1-2mm.
3）样品最小光切厚度：40nm
4）Z轴最大分辨率：0.35um.
五、生物学应用
共聚焦显微镜技术随着荧光探针及激光器的迅速发展，已越来越被广泛的应用于生物医学各个研究领域．
1 、细胞间通讯的研究:多细胞生物体中，细胞间相互影响和控制的生物学过程称为细胞间通讯，它被认为在细胞增殖和分化中起着非常重要的作用，激光扫描共聚焦显微镜可测量传递细胞调控信息的一些离子、小分子物质。

2 、荧光的定量定位分析:激光扫描共聚焦显微镜可对单、双或三标的细胞及组织标本的荧
光进行定量定位分析，也非常适合于高灵敏度的快速免疫荧光测定，可以准确监测抗原表达、荧光原位杂交斑点及细胞结合和杀伤的形态学特性并作定量分析。

3 、细胞物理化学测定:激光扫描共聚焦显微镜可对细胞形状、周长、面积、平均荧光强度及细胞内颗数等参数进行自动测定。

能对细胞的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA, RNA,酶和受体分子等细胞内特异结构的含量、组分及分布进行定量、定性、定时及定位测定。

4 、粘附细胞的分选:细胞分选有两种方式，一种适用于数量较多细胞的分选，即在特制的培养皿上有两类细胞，一类是未作荧光染色的细胞群，另一类是作荧光染色的细胞群，利用高能激光把染色的细胞群杀死，而把未染色的细胞群保留并且继续培养。

一种适用于数量较少的突变细胞，转移细胞和杂交瘤细胞，即利用高能量激光于底部带膜的特制培养皿上在欲选细胞周围切割成八角带，而非选细胞则因在该几何形状之外而除去。

5、 pH、细胞内离子分析:利用荧光探针，激光扫描共聚焦显微镜可对细胞内各种离子的含量及动态变化作毫秒级定时定量分析，较多的是对细胞内钙离子浓度及浓度变化的测量。

利用SNAFI类探针可对细胞内pH进行测定。

6 、激光细胞显微外科手术:激光扫描共聚焦显微镜将激光作“光子刀”使用，进行细胞瞬间穿孔，染色体精确切割，细胞器烧灼，神经元突起切除等一系列细胞外科手术。

7 、光陷阱技术该技术利用激光的力学效应将一个微米级大小的细胞器或其它结构钳于激光束的焦平面也可称为光钳。

利用光钳移动细胞的微小颗粒和结构(如染色体、细胞器)进行细胞融合，机械刺激及细胞骨架弹性测量等
8 、细胞膜流动性测定:细胞膜荧光探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，该旋转依赖于膜的流动性，因此极性测量可间接反映膜的流动性，激光扫描共聚焦显微镜利用专用机算机软件可对细胞膜的流动性进行定量和定性分析
9 、光活化技术:生物体内许多重要的活性物质和化合物均可形成笼锁化合物。

激光扫描共聚焦显微镜即具有光活化测定功能，可控制使笼锁探针分解的瞬间光波长和照射时间，从而人为地控制多种生物活性产物及其它化合物发挥作用的时间和空间。

10 、组织光学切片及三维图像重建:共聚焦成像利用照明点与探测点共扼这一特性，可有效抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，因而具有深度识别能力及纵向分辨率，可着到较厚生物标本的细节，以一个徽动步进马达，可以逐层获得二维光学横断面图像，所以被形象地称＂显微CＴ＂。

标本的各层光学切片经计算机图像处理及三维重建软件，可以得到其三维立体结构，从而进行各侧面直观的形态学观察
11、荧光漂白恢复(FRAP)技术：此技术借助于高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，用激光扫描共聚焦显微镜可直接对此扩散速率进行检测，由此揭示细胞和各种变化的机制，因而可以研究细胞骨架构成、核模结构和大分子组装等
12 、多光子技术：现在多家公司开发出多光子LSCM，多光子技术就是使一个荧光分子同时吸收两个或两个以上光子的技术。

这样就可以利用数个低能光子同时释放的能量代替单个高能光子的作用。

这项技术的使用使我们可以采用长波长激发光达到短波长激发光的激发效果，尤其是无需使用紫外光源而达到检测紫外探针的目的。

其主要特性表现为：(1)长波长激光尤其是红外激光穿透力强，使我们能观察样品更深层的细节。

(2)由于低能光子的能量只有在焦面处才增强到能够激发出荧光，因此大大减小了光束所经过的细胞或组织部分的光漂白现象，使被检测细胞所受的光损伤大大减小，从而延长了对活体的观察时间。

六、在医学各领域中的应用举例
１、对多项指标的定性、及动态变化检测：
同时测定细胞内游离钙离子和ＰＨ值的动态变化
细胞受各种因素作用时，胞内Ca2+和pH发生变化，不过由于缺乏能同时检测胞内Ca2+和pH动态变化的方法，二者之间的关系仍不很清楚。

近年来，随着激光扫描共聚焦显微镜技术和荧光探针的开发利用，新一代的胞内游离Ca2+探针fluo-3/AM(13-15)（典型的单波长荧光探针，发射波长较长，荧光选择性强，自身无荧光，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解并与游离钙结合后才发出荧光，能有效地避免非特异性染色，不需要紫外光激发，避免了紫外光对活细胞样品的损伤，不需要制作工作曲线。

）和pH荧光探针SNARF-1/AM被分别用于胞内游离Ca2+和pH变化的检测。

根据fluo-3/AM和胞内游离Ca2+结合后在波长530 nm处荧光强度随游离Ca2+浓度升高而增强，而SNARF-1的荧光强度在波长>605 nm时随胞内pH升高而增强，利用它们的激发波长均为480 nm以及fluo-3/AM的荧光强度不受SNARF-1/AM影响等特点，用二者分别标记小鼠腹腔巨噬细胞，在激光扫描共聚焦显微镜下，同时用最适发射波长分别为530 nm和大于605 nm的检测器1和检测器2检测巨噬细胞内fluo-3和SNARF-1的荧光强度变化。

如图３所示：小鼠巨噬细胞未受到刺激时，fluo-3和SNARF-1荧光强度同样不变。

加入维拉帕米（终浓度1μmol/L）后200 sec，fluo-3/AM的荧光强度下降了0.42，SNARF-1/AM的荧光强度下降了0.22．如图４所示：加入肾上腺素（终浓度1×10μmol/L）后200 s，fluo-3/AM的荧光强度上升0.36，SNARF-1/AM荧光强度下降0.21。

2、定量检测：
以测定细胞内游离钙离子浓度为例：
indo-1是典型的双发射荧光探针，用355nm光激发时，其发射光谱发生变化：无钙时，在485nm左右有个发射峰；结合钙后，在405nm处有发射峰。

两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，此比值与工作曲线相比即可得出细胞内游离钙的浓度。

因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度，其优点为用两个接收装置同时采集双发射波长光学信号，可增加时间分辨率，不易进入细胞器，缺点为光褪色较快，其发射光谱的短波区可能受细胞内自发荧光的影响。

3、三维重组：
观察冻存对卵母细胞的影响(16)：
运用激光扫描共聚焦显微术的光学切片和三维图像重建技术研究冻存对自发性高血压大鼠（SHR）卵母细胞的结构尤其是对纺锤体、染色体的影响，以及冻存对体外受精的影响。

方法：将冻存复苏后形态正常的卵母细胞放入已获能的精子悬液中，10小时后取出卵母细胞，固定。

固定后的卵母细胞经特定荧光染料染色后，用CLSM进行观察。

Ex488,EmBP505-550nm的波长用于观察减数分裂纺锤体或微管的信号;Ex361,EmBP385-470nm用来观察染色体的兰色荧光。

结果：通过激光扫描共聚焦显微镜来评价冻存后胚胎的形态学存活率，凡是透明带完整(质膜完整以及折光均匀的细胞质的卵母细胞被认为形态学存活。

经过冻存后只有42.9%的卵母细胞形态正常图5.1是一个冻存后形态学正常的卵母细胞。

形态学正常的冻存复苏后卵母细胞的减数分裂纺锤体和染色体进行免疫荧光染色。

正常的纺锤体由微管组成，呈桶状结构，着丝点微管连接染色体着丝点和纺锤体极，染色体有规律的排列在纺锤体的赤道面上，染色体形状致密，与纺锤体的轴心呈垂直排列。

不正常的纺锤体的微管数量减少、纺锤体体积变小、或者纺锤体被破坏，甚至消失，同时染色体的排列变得松散。

如图5.2显示的是一个冻存后卵母细胞正常的桶状纺锤体和致密染色体。

图5.3则是一个冻存后体积缩小的卵母细胞纺锤体。

除了组成纺锤体外，微管同时还均匀地散在分布于卵母细胞的细胞质中，呈星体状，每个星体有一个中心。

但是，伴随着纺锤体的变化，细胞质微管也会受到破坏，甚至消失。

图5.4是30个连续图像，从各个层面说明冻存后形态正常的未受精卵散在分布于细胞质中的微管结构。

六：结语
激光扫描共聚焦显微镜是近80年代以来发展起来的高科技医学图像分析仪器，与传统的荧光显微镜相比，分辨率有了进一步提高，最重要的是清晰度大为提高。

激光扫描共聚焦显微镜的发明是对电子显微镜的一个补充，在生物学尤其是细胞生物学领域有着广阔的应用前景。

当然，LSCM也存在一些不足，比如激光管有使用寿命的限制；检测过程中需要使用荧光染料，增加了检测成本；激光存在荧光漂白作用及细胞毒性，应在使用过程中加以关注。

随着生命科学研究的深入，生物医学研究已进入后基因组时代，基因组学的研究从结构基因组学过渡到功能基因组学，对功能蛋白质组学的研究也不断深入，同时，纳米技术在不同学科、不同领域中得以迅猛发展，如果单纯依靠某种技术、某种仪器远远不能满足研究要求。

/0!1 与电子显微镜、原子力显微镜、生物质谱、核磁共振等技术相结合，必将在纳米技术、大分子结构与功能等新兴研究方向上发挥重要作用。

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