高效液相分析方法开发分享
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在酸性条件下很多化合物都以离子形式存在，为了提高样 品的分离度，尽量使用大比例的水做梯度的起始。
对于添加缓冲盐的流动相要注意梯度变化过程中流动相组 成改变时不能有盐析出。
ppt课件
例：氨基酸分析
时间 /min 起始 0.5 18 19 29.5 33 36 45
流速 ml/min
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
ppt课件
流动相的优化：
单独使用酸不行就要考虑使用缓冲盐，选择原则：简单、 稳定、缓冲能力强，需要调PH值时要有相应的酸或碱。
常用的缓冲盐：磷酸盐、钾盐、钠盐、醋酸盐，盐浓度在 10-20mM左右。
使用缓冲盐时要注意流动相混合后盐可能析出的问题和盐 背景吸收导致基线漂移严重的问题。
ppt课件
A液%
100 99 92 91 83 0 100 100
B液%
0 1 4.8 9 17 60 0 0
C液%
0 0 0 0 0 40 0 0
曲线
* 11 6 6 6 11 11 6
源自文库
时间 /min 起始 0.5 15 19 32 35 39 50
流速 ml/min
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
流动相调整小秘诀
秘诀一：由强到弱 秘诀二：三倍规则（每减少10%的有机溶剂，保留因子约
增加3倍） 秘诀三：粗调转微调
ppt课件
四.梯度的优化
梯度的优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜 率来调整样品的保留时间，优化样品的分离度。
有机相起始比例越小，样品保留时间越长，随着梯度的变 化，样品出峰的先后顺序也有可能改变。
ppt课件
分离度： 1.50
ppt课件
柱温 流速 溶样
五.其他
ppt课件
目录
ppt课件
一.色谱柱的选择
基本要求：有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度。 色谱柱的基本要素：填料，柱长，粒径，直径。 例如：5μm填料的色谱柱长要250mm；3.5μm填料的柱长要
150mm等等。柱长和粒径小了，流速增加很多，能节约分 析时间，提高工作效率。
填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的 分析柱都在100A左右，能满足分析检测需要。
ppt课件
我们现有的色谱柱：
（1）用于胶原蛋白大分子含量测定：Symmetry C18 5.0μm 4.6mm*250mm 100A （Waters）
（2）用于氨基酸分析的：AccQ Tag For Hydrolysate Amino Acid Analysis 3.9mm*150mm （Waters）
A液%
98 98 92 85 65 0 98 98
B液%
1.2 1.2 4.8 10 21 60 1.2 1.2
C液%
0.8 0.8 3.2 5 14 40 0.8 0.8
曲线
* 6 6 6 6 11 11 6
流动相A：醋酸盐-磷酸盐缓冲液
流动相B：色谱乙腈 流动相C：纯化水
ppt课件
分离度： 0.823
高效液相分析方法开发分享
梁杏
ppt课件
HPLC方法建立前的准备工作
分析样品的结构，熟悉样品的基本性质。
查阅文献
有类似的方法 可参考借鉴
无类似的方法可借鉴 分析结构
紫外吸收
正向或反相色 谱进行分离
流动相的 选择等
紫外检测 器
蒸发光散 射检测器
ppt课件
色谱柱的选择 检测波长的选择 流动相的选择 梯度的优化 其他
系统压力低 毒性大
ppt课件
流动相的优化：
优化主要在水相上做改变，水里加酸、加盐，从而改善峰 型，提高分离度。
常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸等，通过加酸改 变流动相的PH值，从而改善样品的分离度和峰形。色谱柱 主要都是硅胶基质，会造成样品峰拖尾，低PH帮助抑制硅 胶基活性，减小拖尾。水溶液中添加0.1%的磷酸或者TFA其 PH值大概2左右。所以液相分析方法时首选水加0.1%的磷酸 或者TFA，然后再以此为基础做优化。
二极管阵列检测器（DAD、PDA）：做色谱峰纯度检查和选 择检测波长。
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三.流动相的选择
流动相的有机相：一般选择甲醇和乙腈
甲醇 活性高，能与某些样品反应 在低波长有紫外吸收，降低分析灵敏 度，检测波长高于220nm
系统压力高 毒性小
乙腈 洗脱能力比甲醇强，很少与样品反应 截止波长比甲醇低20nm增加了检测出 在低波长下才有吸收的杂质的可能性
ppt课件
（1）API分析方法开发，需要做色谱柱的筛选实验，最少 使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要求来自不 同厂家（Waters，Agilent，Phenomenex…)。
（2）制剂分析方法选择色谱柱与API相似，但筛选实验较 简单，一般根据样品性质直接选取一两只普通C18或者其他 色谱柱进行比较。
（3）用于外部校正：Supersil ODS2 5.0μm 4.6mm*250mm
（依利特）
（4）新柱子： Symmetry300 C18 5.0μm 4.6mm*250mm
（Waters）
专柱专用
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二.检测波长的选择
紫外扫描：将样品配制成一定浓度，在紫外分光光度计上 扫描，最大吸收处的波长作为检测波长。
对于添加缓冲盐的流动相要注意梯度变化过程中流动相组 成改变时不能有盐析出。
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例：氨基酸分析
时间 /min 起始 0.5 18 19 29.5 33 36 45
流速 ml/min
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
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流动相的优化：
单独使用酸不行就要考虑使用缓冲盐，选择原则：简单、 稳定、缓冲能力强，需要调PH值时要有相应的酸或碱。
常用的缓冲盐：磷酸盐、钾盐、钠盐、醋酸盐，盐浓度在 10-20mM左右。
使用缓冲盐时要注意流动相混合后盐可能析出的问题和盐 背景吸收导致基线漂移严重的问题。
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A液%
100 99 92 91 83 0 100 100
B液%
0 1 4.8 9 17 60 0 0
C液%
0 0 0 0 0 40 0 0
曲线
* 11 6 6 6 11 11 6
源自文库
时间 /min 起始 0.5 15 19 32 35 39 50
流速 ml/min
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
流动相调整小秘诀
秘诀一：由强到弱 秘诀二：三倍规则（每减少10%的有机溶剂，保留因子约
增加3倍） 秘诀三：粗调转微调
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四.梯度的优化
梯度的优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜 率来调整样品的保留时间，优化样品的分离度。
有机相起始比例越小，样品保留时间越长，随着梯度的变 化，样品出峰的先后顺序也有可能改变。
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分离度： 1.50
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柱温 流速 溶样
五.其他
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一.色谱柱的选择
基本要求：有较高的理论塔板数，能提供更好的分离度。 色谱柱的基本要素：填料，柱长，粒径，直径。 例如：5μm填料的色谱柱长要250mm；3.5μm填料的柱长要
150mm等等。柱长和粒径小了，流速增加很多，能节约分 析时间，提高工作效率。
填料的孔径对于小分子合成药物不需要考虑，普通的 分析柱都在100A左右，能满足分析检测需要。
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我们现有的色谱柱：
（1）用于胶原蛋白大分子含量测定：Symmetry C18 5.0μm 4.6mm*250mm 100A （Waters）
（2）用于氨基酸分析的：AccQ Tag For Hydrolysate Amino Acid Analysis 3.9mm*150mm （Waters）
A液%
98 98 92 85 65 0 98 98
B液%
1.2 1.2 4.8 10 21 60 1.2 1.2
C液%
0.8 0.8 3.2 5 14 40 0.8 0.8
曲线
* 6 6 6 6 11 11 6
流动相A：醋酸盐-磷酸盐缓冲液
流动相B：色谱乙腈 流动相C：纯化水
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分离度： 0.823
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梁杏
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HPLC方法建立前的准备工作
分析样品的结构，熟悉样品的基本性质。
查阅文献
有类似的方法 可参考借鉴
无类似的方法可借鉴 分析结构
紫外吸收
正向或反相色 谱进行分离
流动相的 选择等
紫外检测 器
蒸发光散 射检测器
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色谱柱的选择 检测波长的选择 流动相的选择 梯度的优化 其他
系统压力低 毒性大
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流动相的优化：
优化主要在水相上做改变，水里加酸、加盐，从而改善峰 型，提高分离度。
常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸等，通过加酸改 变流动相的PH值，从而改善样品的分离度和峰形。色谱柱 主要都是硅胶基质，会造成样品峰拖尾，低PH帮助抑制硅 胶基活性，减小拖尾。水溶液中添加0.1%的磷酸或者TFA其 PH值大概2左右。所以液相分析方法时首选水加0.1%的磷酸 或者TFA，然后再以此为基础做优化。
二极管阵列检测器（DAD、PDA）：做色谱峰纯度检查和选 择检测波长。
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三.流动相的选择
流动相的有机相：一般选择甲醇和乙腈
甲醇 活性高，能与某些样品反应 在低波长有紫外吸收，降低分析灵敏 度，检测波长高于220nm
系统压力高 毒性小
乙腈 洗脱能力比甲醇强，很少与样品反应 截止波长比甲醇低20nm增加了检测出 在低波长下才有吸收的杂质的可能性
ppt课件
（1）API分析方法开发，需要做色谱柱的筛选实验，最少 使用三种不同类型的色谱柱，每种类型三只，要求来自不 同厂家（Waters，Agilent，Phenomenex…)。
（2）制剂分析方法选择色谱柱与API相似，但筛选实验较 简单，一般根据样品性质直接选取一两只普通C18或者其他 色谱柱进行比较。
（3）用于外部校正：Supersil ODS2 5.0μm 4.6mm*250mm
（依利特）
（4）新柱子： Symmetry300 C18 5.0μm 4.6mm*250mm
（Waters）
专柱专用
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二.检测波长的选择
紫外扫描：将样品配制成一定浓度，在紫外分光光度计上 扫描，最大吸收处的波长作为检测波长。