第5章 常见免疫学检测技术-荧光、化学发光

第五章

常见免疫学检测技术

第二节荧光免疫检测

l 用荧光素标记抗体或抗原，与相应的抗原或抗体反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为荧光免疫技术

l 包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，但在实际工作中荧光抗原技术很少应用荧光显微镜技术荧光免疫测定技术

常见技术

一、荧光的基础知识

（一）荧光

（fluorescence）

Ø某些物质能吸收外界能量进入激发状态，使处于基态的电子被激发至激发态，当其再回到稳定基态时，多余的能量会以电磁辐射的形式释放，即发出荧光，这类物质被称为荧光素

Ø由光激发所引起的荧光，为光致荧光

------荧光免疫技术

Ø由化学反应所引起的荧光，为化学荧光------化学发光技术

Ø荧光免疫技术的标记物一般为光致荧光物质，当受一定波长光激发后，在极短时间内发出长于激发光波长的荧光，一旦停止供能，荧光即消失（约持续10-7～10-8s）

Ø荧光效率：指荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率

Ø荧光效率= 发射荧光的光量子数/吸收光的光量子数

Ø发射光谱：是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度

Ø激发光谱：是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光强度

Ø荧光寿命：指荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间

Ø各种荧光物质的荧光寿命不同

Ø荧光猝灭：荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光猝灭

Ø荧光猝灭物质如亚甲基蓝、碱性复红、伊文思蓝、碘溶液等

Ø荧光偏振

F H －F

L

P＝──────

F H ＋F

L

ØP为荧光偏振光强度；F H、F L分别表示激光起偏器和荧光检偏器的透射轴垂直和平行时测得的荧光强度。P值在0～1之间，等于0表示完全不偏振，在0～1之间表示部分偏振

一、荧光的基础知识

（二）荧光物质

（fluorescent material）

1.荧光色素/荧光素

Ø能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料

Ø许多物质都可产生荧光，但并非都可用作荧光染料

1.荧光色素

Ø荧光色素的条件

•有能与Pr形成共价健的基团，结合不易解离，未结合的易除去

•荧光效率高（特别是结合后）

•荧光颜色与背景组织颜色对比明显

•结合后不影响Pr性质

•安全无毒，无附加抗原性

1.荧光色素

Ø常用于标记的荧光色素

（1）异硫氰酸荧光素（FITC）

一分子的IgG虽然有可86可供连接的赖氨酸残基，但最多只能标记15-20个FITC

（2）四乙基罗丹明（RB200）

广泛用于双重染色等

（3）四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）

2.其它荧光物质

（1）镧系螯合物

铕、铽、钐、铈等的螯合物经紫外线激发后可发射强的特征性荧光

（2）荧光底物即经酶作用后产生荧光的物质（3）量子点纳米晶体

一种半导体晶体材料的纳米颗粒，直径

<10nm；不同材质、不同大小的量子点可发出不同的荧光；其荧光强度较荧光染料类高1000倍，化学性质稳定，荧光持续时间长

荧光抗

体技术

荧光免

疫技术非均相～，如时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定

流式荧光免疫技术

荧光免疫测定均相～，如荧光偏

振免疫测定

荧光免疫技术的分类

二、荧光抗体技术

（一）基本原理

Ø将荧光色素与特异性抗体以共价健牢固结合，而不影响抗体的活性，成为荧光标记抗体，经免疫反应，光激发，检测荧光判定结果

（二）荧光抗体技术方法

Ø主要分五个步骤：①高效价免疫血清的制备及抗体纯化；②抗体的荧光色素标记；③标记抗体纯化；④荧光标记抗体染色；⑤荧光染色标本显微镜观察

（三）荧光抗体制备

1.荧光素的标记（与抗体结合）

2.荧光抗体的纯化

3.荧光抗体的鉴定

4.荧光抗体的保存

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（三）荧光抗体制备

1.荧光色素的标记

⑴透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体积小

的抗体溶液的标记②标记较均匀，非特异荧光较低

⑵搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品体积

较大的抗体溶液的标记②标记时间短、效率较高，荧光素用量节省③影响因素多，非特异荧光较强

详细方法

1.荧光色素的标记

⑶标记影响因素：

①温度:低--标记时间长，高--标记时间短

②pH值:8.8-9.5为宜。pH低时，标记较慢，pH

值偏高（>10），抗体易变性

③抗体量：含量低，标记慢，以20-25mg/ml为

宜

④荧光素纯度：>75%

⑤荧光素用量：根据荧光素纯度、标记温度、

实验目的而定

2.荧光抗体的纯化

⑴除去游离荧光素及其降解产物

透析或凝胶过滤（Sephadex G-25）

⑵除去过度标记和未结合荧光素的抗体

离子交换色谱（DEAE）

⑶除去非特异反应物质

正常大、小鼠或豚鼠、家兔肝粉吸收（与标记抗体同种动物）

v 荧光素与蛋白结合率：

F/P=v 抗体效价：双向免疫扩散试验

v 抗体特异性：吸收试验、抑制试验v 抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释

3.荧光抗体的鉴定

nm

nm A A A 495280495nm

35.087.2×−×4.荧光抗体的保存

低温、避光、分装