发酵工程 15-3柠檬酸发酵生产

1968年上海酵母厂首先建立淀粉原料的深层发酵法生
产柠檬酸的车间；
经三十多年我国科技工作者和生产工人的不懈努力，
先后选育了5代薯干原料发酵柠檬酸的高产菌种和适合 淀粉、木薯、葡萄糖母液以及玉米粉等原料的生产菌 种及发酵工艺。
目前世界柠檬酸年产量近一百万吨，中国、美
国、欧洲各国为主要生产国。
1）产酸指示剂法
2）透明圈法
3）对二甲氨基苯醛法
柠檬酸的发酵生产
1、原料及其预处理
用于柠檬酸发酵生产的原料以糖质原料为主，
包括甘薯、木薯、马铃薯，玉米、小麦、大米 等，各种淀粉、水解糖、糖蜜等。
含淀粉或糖质的原料，发酵前需进行预处理，
如去杂质、去霉块、粉碎、液化、去除金属离
子等。
4、酸解
柠檬酸钙与硫酸等强酸作用，使柠檬酸钙转变
为柠檬酸游离出来，同时形成硫酸钙，由于后 者溶解度极小，难溶于水而形成沉淀，从而达
到进一步分离纯化作用。
由于石膏存在二水、半水和无水三种形态；
温度低时易形成二水石膏，但它是一种易于折
断的针状结晶，不利于过滤；
80℃以上形成较多的半水石膏，它成片状结晶，
株能产生柠檬酸；
1923年美国Pfizer公司采用黑曲霉发酵法工业
化生产柠檬酸；
1952年美国Miles公司首先采用深层发酵法生
产柠檬酸，从而大大地推动了世界柠檬酸发酵
工业的迅猛发展。
我国的生产情况
我国1967年首先在哈尔滨和平糖厂建立了一座以甜菜
糖蜜为原料的浅盘法柠檬酸发酵生产车间；
成1 mol柠檬酸，这样可获得较高的糖酸转化 率（以质量计，葡萄糖合成柠檬酸的理论转化 率为106.7%，对一水柠檬酸的理论转化率为 116.7%）。
黑曲霉中也存在TCA和乙醛酸循环的酶系，但
在产酸阶段，这两个循环均被阻断或减弱。
合成柠檬酸所需的草酰乙酸必须由含三碳的羧
酸来提供，经证实，在黑曲霉产柠檬酸阶段主 要是通过丙酮酸羧化酶的催化作用，使丙酮酸
的一种传统方法。
柠檬酸的提取工艺
提取柠檬酸的方法主要有钙盐法、离子交换法、
萃取法、电渗析法以及近年来发展起来的色谱
分离法。
但目前生产上普遍采用的仍是钙盐加离子交换
的提取方法。
1、发酵液的预处理
预处理是将发酵液加热至75－90℃，以杀死柠
檬酸产生菌及其它杂菌，终止发酵作用，同时 使发酵液中部分蛋白变性、絮凝、降低醪液黏
2）发酵设备
柠檬酸深层发酵一般都采用不锈钢机械搅拌通
气发酵罐，大部分为50-100m3，目前已发展
至250-400m3，国外的发酵罐为400-600m3。
采用二挡搅拌，为了减少对丝状菌丝的剪切作 用，多用箭叶式搅拌器。
2）发酵工艺
柠檬酸发酵过程包括斜面培养、麸曲制备、种
子罐培养和发酵几个阶段。
途径是：葡萄糖经EMP或HMP降解，形成丙酮酸；
丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，另一方面经CO2
固定羧化成草酰乙酸；然后草酰乙酸与乙酰CoA缩合生 成柠檬酸。
产酸期葡萄糖主要通过EMP降解，对柠檬酸的
发酵生产是非常重要的。
因为1mol葡萄糖经EMP降解可得到2 mol丙酮
酸，再经脱羧和CO2固定后，使1 mol葡萄糖合
6、结晶
将净化后的柠檬酸液加热除去一定水分。蒸发
浓缩至一定浓度的溶液进入结晶罐后降低温度 就出现结晶。
一水柠檬酸的结晶温度控制在10℃左右，无水
柠檬酸的结晶温度为40℃。
碳酸钙
钙盐
发酵液
过滤
中和、洗涤
酸解、过滤
净化
母 液
菌体、残渣
石膏渣
浓缩、结晶
离心
干燥、包装
成品
（CaO）、熟石灰、氯化钙、碳酸钙等均可作 为中和剂，最常用的是碳酸钙。
在 中 和 过 程 中 并 不 是 一 次 反 应 就 形 成
Ca3(C6H5O7)2•4H2O；
而是随着反应液中Ca2+ 的增加使柠檬酸分
子中3个羧基上的H＋逐步被取代，
因 此 反 应 中 将 形 成 CaH4(C6H5O7)2 和 CaH
酶和糖化酶，即使在低pH下两种酶仍具有大部 分活力；
能耐受高浓度的柠檬酸，但不能利用和分解柠
檬酸；
能抗微量金属元素，特别是抗Mn2+ 、Zn2+ 、
Cu2+和Fe2+等金属离子；
在摇瓶和深层发酵时能产生大量细小的菌丝球； 具有旁系呼吸链活性，利用葡萄糖时不产生或
少产生ATP。
3、柠檬酸产生菌的筛选
2、柠檬酸的深层发酵法
深层通气发酵是柠檬酸发酵生产的主要方法。
国内以淀粉质粗原料为培养基，发酵产酸一般
为11-13%，最高达15%，发酵周期为50-70h。
国外以淀粉水解糖为原料，产酸可达19%，发
酵周期5d以上。
1）深层发酵法的生产工艺流程
斜面 麸曲 种子 无菌空气 原料 粉碎 液化 发酵 分离提取
有柠檬酸生产菌才能积累大量柠檬酸。
柠檬酸发酵的生产菌种
1、柠檬酸的产生菌
柠檬酸是生物机体TCA循环的中间代谢产物之
一，但并非所有能产柠檬酸的微生物都可作为 柠檬酸的生产菌种。
曲霉，特别是黑曲霉（Aspergillus niger）能分
泌大量的柠檬酸，目前用于工业化生产的菌种
几乎都是黑曲霉。
我国年产量达三十万吨，但我国的柠檬酸消费
和应用方面远落后于发达国家，我国柠檬酸
80%用于出口。
黑曲霉的柠檬酸生物合成途径
已知生长在葡萄糖培养基上的黑曲霉存在着糖酵解途
径（EMP）、磷酸戊糖途径（HMP）、三羧酸（TCA） 循环和乙醛酸循环的酶系。
现在普遍认为黑曲霉利用糖类产生柠檬酸的生物合成
固定CO2而形成草酰乙酸。
从葡萄糖合成柠檬酸的总反应式为：
2C6H12O6 + 3O2 2C6H8O7 + 4H2O
黑曲霉合成柠檬酸的调节
柠檬酸的TCA循环中的一员，又是糖代谢的一
个重要调节因子，即它是酵解途径中第一个调 节酶（磷酸果糖激酶，PFK）的抑制物。
在正常细胞内，一般是不会积累柠檬酸的，只
麸曲种子的培养温度约34℃，培养1d后要“敲
瓶”一次，使之上下翻动。培养好的麸曲应仔 细观察有无其它霉菌污染并抽样作摇瓶产酸测 定，合格者在20℃以下温度保藏。
种子罐培养 种子罐体积一般为发酵罐的1/10，薯干浓度为
16-20%，比发酵罐为浓度稀些，但需添加一定 量的含氮物质，如硫酸铵、尿素或适量的麸皮
柠檬酸发酵生产
柠檬酸简介
1、柠檬酸的化学结构
2、柠檬酸的用途
食品领域
医药、化妆品及其它行业
3、柠檬酸的生产
提取：1784年瑞典化学家Scheel首先从柠檬
汁中分离得到柠檬酸结晶；1860年意大利开 始用石灰乳从果汁中提取和生产柠檬酸；
发酵生产： 1916年美国科学家Currie等发现多种黑曲霉菌
3、柠檬酸的固体发酵工艺
利用农副产品加工后的副产物如甘薯、木薯的
薯渣、苹果渣等，添加麸皮、米糠等含蛋白辅 料和无机盐，就可进行固体发酵生产柠檬酸。
固体发酵工艺流程
薯渣＋辅料 ＋水 蒸煮 冷却 补水
斜面菌 种
一级麸 曲
二级麸 曲
浸泡提 取
曲房培 养
装 盘
4、液体表面发酵法生产柠檬酸
表面发酵法也称浅盘发酵法，它是柠檬酸生产
斜面种子培养。
斜面培养基为10-12Bx的麦芽汁或米曲汁，也
可采用20%马铃薯煮出汁琼脂培养基。33-35℃
培养4-5d，至斜面长满孢子即可。
麸曲制备。 用1000ml三角烧瓶装麸皮40g左右，麸皮选用
较粗者为好，必要时应先用水洗涤除去淀粉。 麸曲的含水量要合适，一般控制在60-65%左右，
(C6H5O7)2•3H2O两种中间物。
3种柠檬酸钙在水中的溶解度差异很大，四水
柠檬酸钙的溶解度最小，故中和时应投入足量 的中和剂使所有的柠檬酸都形成四水的钙盐。
另一方面柠檬酸钙在不同温度下的溶解度差异
也很大，特别是在80℃热水中它们的溶解度远
比20或50℃小，故中和反应及中和后洗涤的湿
度都需控制在80℃。
度利于过滤。预处理加热时间不能太长，若破
坏菌丝球则影响过滤。
2、过滤
我国采用薯干粗原料发酵生产柠檬酸，发酵
液中除菌丝外，还含有大量的原料残渣，固 形物较多，因此不宜采用各种离心或固液分
离设备，目前常用的是各种板框压滤机和真
空带式过滤机。
3、中和
柠 檬 酸 与 Ca2+ 作 用 生 成 柠 檬 酸 钙 。 生 石 灰
但是，以石油、乙酸、乙醇等为原料时，似乎
都是酵母才能作为柠檬酸的生产菌株，如解脂 假丝酵母，热带假丝酵母等。
但酵母利用石油为原料生产柠檬酸无一例外伴
随着产生相当数量的异柠檬酸。
2、高产ห้องสมุดไป่ตู้檬酸菌株的特征
在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长不太好，
形成的菌落较小，形成孢子的能力也较弱；
能耐受高浓度的葡萄糖并产生大量酸性α -淀粉
等。种子罐培养温度34℃，培养时间16-24h，
至略微产酸即可转入发酵罐中。
发酵 培养基投料浓度视淀粉含量而定，一般为含总
糖13-15%。50-100m3罐的搅拌转速为90110rpm。培养温度35℃。采用二级通风，前期
（16-24h）低风量，以利于菌丝生长和糖化酶
的作用，以后通风比显（1：0.1-0.15）(体积 比)。发酵时间50-70h，产酸12－15%，糖酸转 化率90－104%。
形成的滤饼疏松易过滤和洗涤。国内酸解温度 多采用80－90℃。
5、净化
净化工艺包括脱色和离子交换树脂除去杂质离
子。
酸解液中含有色素物质，可用活性炭脱色。
通过阳离子交换树脂可除去Ca2+、Fe2+等阳离
子，最常用的是732树脂。若柠檬酸液中含有
较多SO42-等阴离子，可用阴离子交换树脂除去。