组织学技术shi

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特殊染色


MASSON染色（胶原纤维）
一.试剂配制： 1.Masson复合染色液 丽春红 0.7g 酸性品红 0.3g 蒸馏水 99ml 冰醋酸 1ml 2. 1%磷钼酸水溶液 磷钼酸1g 蒸馏水100ml 3. 2%苯胺蓝溶液 苯胺蓝 2g 冰醋酸 2ml 蒸馏水 100ml
注意事项和原则： （一）器材准备 锋利 洁净 无污染 （二）处死动物的方法选择 小动物（大、小鼠）---断头或脱颈椎法 较大动物（兔、猫）----麻醉或空气栓塞法 大动物（狗、猪）------麻醉法
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（三）取材原则
1.准确 熟悉动物的解剖生理结构 2.快速 一般在动物死后2小时以内取 3.切取 ①切取的组织块应小而薄，大小一般以 2cm×1.5cm×0.3cm为好，免疫组化标本大小以 1cm×1cm×0.2cm为宜。避免拉锯样动作和挤压样动 作 ②皮肤、腔道器官、囊壁组织----切取全层结构 ③骨组织需先脱钙 ④新鲜组织若需保存，先液氮速冻再转入-70 ℃冰箱 4.轻柔 5.低温 4℃
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（三）固定的注意事项


根据研究目的不同选择合适的固定剂 MASSON染色---甲醛升汞、Zenker液 保存细胞内糖原---Carnoy液 尿酸盐结晶---无水乙醇 固定液的用量 总体积的5-10倍以上 固定时间的选择 3-24h
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六.染色
（一）HE染色原理 1.细胞核染色原理 苏木素是一种碱性染料，可使组织细胞中的酸 性物质（又称嗜碱性物质）染成紫蓝色，如细 胞核中的染色质等 2.胞浆染色原理 伊红是一种酸性染料，可使组织细胞中的碱性 物质（又称嗜酸性物质）染成红色，如多数细 胞的细胞质、核仁等在H&E染色的切片中均呈 红色，很易跟细胞核区别。
组织化学与细胞化学
第一章

组织制片技术与细胞化学技术

组织制片技术：是最为常用的一种标本制作技 术，被广泛应用于涉及组织细胞形态结构、细 胞组分的定位、定量及其 与功能的关系等相 关研究。 细胞化学技术：涉及的范围较广泛。主要包括 酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自 显影技术，示踪细胞化学技术等。
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包埋器
蜡块
粘好的 木块
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载玻 片
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五.切片（蜡带-展片-贴片-烤片）



切片是指将包埋后的组织样品放置于专用切片 机上，制成组织切片的过程。 石蜡切片为常规制片技术，切片机多为轮转式， 切片厚度2-7μm。 应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一 般要求3-5μm左右。
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（四）常用固定液

单一固定液 1．醛类固定剂
10%甲醛，甲醛磷酸缓冲固定液(ph7.2-7.4pbs) 2. 丙酮及醇类固定剂 收缩作用强,乙醇慎用

混合固定液 1.zenker液 光镜研究，最好的固定液。储
备液由重铬酸钾2.5克，溶于蒸馏水 加热搅拌使之溶解， 再加入升汞5克，冷却后过滤，置于棕色瓶中保存。用时 取贮存液95ml,加入5ml冰醋酸，即成zenker液 。 2.Bouin液 冰乙酸、苦味酸、甲醛按1：5:15配置而成
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二、染色步骤

1.常规脱蜡至水 2.苏木素染5min 3.流水冲洗2min,1%盐酸酒精分化1min 4.流水冲洗2min 5.masson复合染色液染5min 6.蒸馏水冲洗2min 7. 1%磷钼酸处理5min 8.不水洗，直接用苯胺蓝复染5min 9.1%冰醋酸水处理1min 10.95%酒精脱水2次，无水乙醇脱水2次，二甲苯透明，中性树胶 封固。 结果：胶原纤维呈蓝色，细胞质，肌纤维和红细胞呈红色，细胞核 呈紫蓝色
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三、分化 与返蓝

1.分化作用 分化是指清除吸附与组织细胞中多余染色剂 的过程。分化可是细胞和清晰度增加，还可清 楚吸附于细胞质的苏木精，为伊红染色提供条 件。 2.返蓝 分化之后，必须立即用水去除切片上的酸而终 止分化，再用弱碱性水，使苏木素染上的核呈 蓝色，这个过程称为返蓝。
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注意事项：




各级乙醇脱水时间，可根据组织块的大小适当 调整。如中途因故不能进行下去，则可将标本 退回到80%酒精中保存。 若组织含水量过多（如胚胎组织），则脱水剂 浓度应由更低级乙醇（如30%-40%乙醇）开 始。 若脱水不尽，切片后蜡块切面会出现凹陷。这 样的蜡块染色效果差，染色是组织也容易脱落 脱水剂容积应为组织块总体积的5-10倍以上。
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第一节
组织制片技术
切片法：取材固定→脱水包埋→切片染色→封片 石蜡切片 树脂切片 火棉胶切片 非切片法：不经过包埋和切片的步骤 涂片 血液、细胞 铺片 肠系膜 磨片 牙、骨
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一.取材
系指细致从生命体获得样品的过程
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（四）细胞取材及制片


印片法 穿刺法 沉淀法 活细胞标本的制作
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二、固定
（一）原理：采用化学试剂配制成固定液，使之渗入组 织细胞中，使蛋白变性凝固，不溶于水和有机溶剂， 以达到保存组织细胞生活时的结构和抗原性 （二）作用： 1、保持结构形态与生活时相似，防止自溶、 腐败 2、硬化作用，利于切片 3、保持抗原和DNA、RNA 4、媒染作用，使组织细胞更易着色 5、区别不同组织成分


固定方法 浸透固定法最常用 固定后处理 组织固定后应充分水洗，去除固定液造成 的人为假象。
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三.脱水与透明
脱水，就是脱去组织的内水，即借某些溶媒置换出 组织内水分的过程。固定后的组织用水冲洗后， 组织中充满水分，妨碍石蜡的侵入，必须用不同 浓度的酒精将组织中的水分脱净。采用梯度酒精 进 行 脱 水 （ 70%-80%-95%Ⅰ-95%Ⅱ- 无 水 乙 醇 Ⅰ-无水乙醇Ⅱ）。 脱水后组织中含有酒精，仍不能与石蜡相融，要用 二甲苯或氯仿替代酒精，组织经过二甲苯后呈现 透明状态，这一过程称为透明。二甲苯处理时间 一般为30mim。
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四.浸蜡、包埋

浸蜡 是指组织块经透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过 程。为使石蜡充分渗入组织，需经过3次浸渍，期间 更换三次石蜡，每次30-60min。第一次浸软蜡（熔点 50-52 ℃ ），后两次用硬蜡（60-62 ℃ ）。 浸蜡要掌握适宜恒温，温度略高于石蜡熔点2-3 ℃， 一般65 ℃. 浸蜡所用时间可根据组织块的大小适当调整。 熔蜡的容积应为组织总体积的5-10倍以上。
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组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3：表 1-3 组织块处理时间表
1 70%乙醇 4℃ 3～4h
2
80%乙醇
4℃
3～4h
3
90%乙醇
4℃
2～3h
4
95%乙醇Ⅰ
4℃
2～3h
5
95%乙醇Ⅱ
4℃
1～2h
6
100%乙醇Ⅰ
4℃
1.5h
7
100%乙醇Ⅱ
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注意事项：

免疫组化的切片需做防脱片处理（涂抹多聚赖 氨酸或APES等）： 多聚赖氨酸液：多聚赖氨酸0.1g，加蒸馏水 10ml，混合后即可涂片。此液不宜多配制。 切片刀要锋利，刀口无缺损。
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德国莱卡手动切片机
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（二）染液配制
1.Harris 苏木精 A液: 苏木素 1.0g 无水酒精 10ml B液：硫酸铝钾（钾明矾） 20g 蒸馏水 200ml 配法：搅拌A液，使苏木素完全溶解备用。将B液加热使 钾明矾完全溶解后加入A液，煮沸后，快速加入氧化 汞0.5g，立刻离开热源，投入冰水中冷却。过滤后即 可使用。 2.伊红 常用0.5%水溶性伊红 3.分色液配制 1%盐酸酒精 70%酒精 99ml 稀盐酸 1ml
注意事项：


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包埋 是指把浸蜡后的组织块，放入装有溶化 的石蜡的包埋器中，被包起的过程。

注意事项： 1.包埋一般用硬蜡，熔点为60-62℃ 2.动作要迅速 3.皮肤、黏膜，肠、子宫等空腔脏器必须垂直 于包埋盒的底部包埋，称为立埋或立包。血管 壁也应立埋。
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（三）HE染色步骤

1.脱蜡至水
二甲苯 5-10min× 2次 无水乙醇×2次 95%乙醇× 2次 80%乙醇× 2次 70%乙醇× 2次 蒸馏水洗2min 2.苏木精染色 苏木精染3-5min，流水冲洗，分化数秒，入水终止，返蓝。 镜下控制，细胞核呈蓝色，胞质无色为佳。 3.伊红 伊红染色1min 4.脱水、二甲苯透明 70%乙醇20s—80%乙醇20s—95%乙醇 2min×2次—无水乙醇2min×2次—二甲苯5 min×3次 5.封片 用中性树胶封固。 结果：细胞核呈紫蓝色，细胞质呈粉红色。
4℃Biblioteka Baidu
1.5h
8
二甲苯Ⅰ
4℃
0.5～1h
9
二甲苯Ⅱ
4℃
0.5１～1h
10
石蜡Ⅰ
60℃
1h
11
石蜡Ⅱ
60℃
2h
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显 微 镜 模 式 图
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德 国 莱 卡 冰 冻 切 片 机
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Masson染色
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