第04章-免疫组化技术-2

SPA常用的酶为HRP，SPA在PAP法中可以代替桥抗。
1．SPA-HRP间接法染色
（1）石蜡切片脱蜡后用0.5% H2O2-纯甲醇液处理 20min，抑制内源性过氧化物酶；
（2）用Tris-HCl 缓冲液洗涤3min×2次；
（3）加一抗血清覆盖切片，37℃孵育30 min；
（4）用Tris-HCl 缓冲液洗涤5min×3次； （5）滴加适当稀释的SPA-HRP，室温处理30min；

SABC法是在一抗体反应后，用已结合生物素的抗IgG 抗体二抗桥接。然后用SABC孵育，使桥抗上的生物素与 SABC中链霉亲和素上的空位结合。最后仍用HRP的底物成 色。在SABC法中，一抗是特异性的，二抗是生物素标记 的二抗，三抗是SABC复合物。SABC复合物与桥抗体之间 是通过生物素结合的，因此SABC复合物没有种属特异性， 可适用于任何种属的一抗。
将荧光、HRP
或胶体金标记
的凝集素直接
用于未处理组
织，简单迅速
但敏感性差。
2．间接法 将生物素化的凝集素直接与切片中的相 应糖基结合，生物素同ABC复合物结合。本法简便、快速， 而且灵敏度高。试剂盒已商品化，可以方便购买。 （1）石蜡切片常规脱蜡至水，加0.01%胰蛋白酶消化 20min； （2）TBS洗涤5min×2次后，在10%BSA中浸育5min， 以减少非特异性染色； （3）加与生物素结合的凝集素（10μ g/ml），孵育 60min，TBS洗涤5min×2次； （4）加ABC浸育60min，TBS洗涤5min×2次； （5）DAB显色，流水洗涤，苏木精复染，脱水、透明、 封片。
三、凝集素免疫组织化学技术
凝集素（lectin）是一种从植物、无脊椎动物和高 等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因能凝集红细胞 （含血型物质）而得名。常用的有植物凝集素 （phytoagglutin，PNA），通常以其来源植物命名，如刀 豆素（conconvalina，ConA）、麦胚素（wheat germ agglutinin，WGA）、花生凝集素（peanut agglutinin， PNA）和大豆凝集素（soybean agglutinin，SBA）等。凝 集素不是来源或参与免疫反应的产物，但具有某些“亲合” 特性，可被免疫组织化学所应用，因此，凝集素免疫组织 化学应称为凝集素组织化学
（二）凝集素在免疫组织化学中的应用
由于凝集素的以上生物学特性，目前已广泛应用 作为细胞分化和成熟的标记、细胞特殊类型标记和肿瘤 细胞凝结素结合特性的研究。凝集素可以被多种标记物 如荧光素、过氧化物酶、生物素等所标记，进行免疫组 织化学染色。
1．直接法 将标记物质直接标记在凝集素上，使
其直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂结合。本法简便、 快速，但灵敏度不高。
将组织切片孵育于凝集素溶液，使之结合于切片上的糖链， 清洗后加凝集素的特异性抗体。该抗体可用FITC、HRP 或胶体金标记；也可不标记凝集素抗体，而将二抗标记， 或使用未标记二抗，再用PAP复合物完成染色。
将凝集素用生物素标记，然后加用标记的抗生物 素蛋白，或ABC复合物使之与生物素结合
3．糖-凝集素-糖法 利用过量的凝集素与切片中特 定的糖基结合，经过冲洗后，凝集素上还存在未被占用的 结合位点，将这些未结合的部位与经过氧化物酶标记的特 异性糖基结合，形成一个三明治样的糖-凝集素-糖复合物。 本法特异性强、灵敏度高，既不像ABC法那样要结合生物 素，也不需要像PAP法那样制备抗体。
（三）SABC免疫组织化学技术 链霉亲和素是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白 质，分子量60000， 含糖链。链霉亲和素也有四个生 物素亲合位点，是一种更理想的抗生物素结合蛋白。 SABC是链霉亲和素-生物素-HRP复合物（streptavidin-biotin-peroxidase complex）的简称。SABC 复合物先将HRP与生物素结合，然后按一定比例将此 复合物与链霉亲和素反应，使每一个链霉亲和素分子 上结合3个带HRP的生物素，留出一个尚未被生物素结 合的空位，可以与各种生物素标记的抗体结合。复合 物上携带的HRP越多，则酶催化的组织化学反应也越 强烈，阳性结果也越明显
2．免疫学特性 SPA具有与人和许多动物如豚鼠、 猪、小鼠、猴等IgG结合的能力。SPA结合部位是Fc段 而不是Fab段，结合后不影响抗体的活性。SPA具有双 价结合力，每分子SPA可同时结合两个IgG分子，也可 一方面与IgG结合，同时与标记物（如荧光素）结合。 另外，与SPA结合后的IgG可用4mol/L鸟嘌呤盐酸盐使 其解离。 3．其他特性 SPA能引起豚鼠离体回肠的收缩， 在吞噬反应中抑制IgG调理素的吞噬和杀菌作用， SPA-IgG能固定人的补体和人、狗、猪的新鲜补体等
（二）ABC免疫组织化学技术 1981年，许世明等建立了抗生物素-生物素-过 氧化物酶法（avidin-biotin-peroxidase complex method，简称ABC法）。ABC是卵白素-生物素结合 的HRP复合物的简称。ABC复合物是先将HRP与生物 素结合，然后按一定比例将此复合物与卵白素反应， 使每一个卵白素分子上结合3个带HRP的生物素，留出 一个能与其它生物素结合的空位。复合物上携带的 HRP越多，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性 结果也越明显
（1）石蜡切片脱蜡至水，用0.01mol/L PBS （pH=7.4）漂洗5min×3次； （2）滴加0.3% H2O2，37℃孵育10min，阻断内源性 过氧化物酶； （3）用0.01 mol/L PBS漂洗5min×3次； （4）滴加10%正常血清/0.3%Triton X-100/0.01 mol/L PBS，37℃孵育10 min； （5）滴加抗小鼠单克隆抗体（一抗）37℃ 1 h或4℃ 过夜，PBS漂洗5min×3次； （6）加生物素标记二抗（效价1:200），室温孵育10 min，PBS漂洗5min×3次； （7）滴加链霉素抗生物素蛋白-HRP液，室温孵育 10min；PBS洗5min×3次； （8）滴加DAB，显微镜下显色5~10min
（11）蒸馏水漂洗，苏木精复染（必要时），脱水、透
明、封片、观察。 评价 ABPAP法较单一PAP法和ABC法更为敏感， 抗体稀释度大大提高，尤其是对抗原性较弱、容易破坏或 丢失的抗原，能得到较好的效果。但ABPAP法较单一PAP 法和ABC法步骤增多、操作复杂，背景着色会相应加深， 而且容易脱片。
一、生物素-抗生物素免疫组织化学技术
（一）基本原理
鸡蛋中含有一种碱性蛋白，属于糖蛋白，也称卵白素 （avidin），分子量68000。卵白素具有4个与维生素H或称 生物素（biotin）亲和力极高的结合位点。生物素是一种小 分子维生素，分子量244，它与卵白素之间的亲和力比抗原 抗体之间的亲和力高100万倍，因而能彼此牢固缔结和而不 影响各自的生物活性。同时，生物素与卵白素都具有与其他 标记物如荧光素、铁蛋白和过氧化酶等结合的能力。目前， 已利用上述特性建立了卵白素-生物素免疫染色系统，为了便 于理解，现在统称卵白素为抗生物素或亲和素，因此，卵白 素-生物素免疫染色系统又称为生物素-抗生物素免疫组织化 学技术
（二）SPA在免疫组织化学中的应用 目前，SPA已广泛应用于免疫球蛋白的制备和 分析、免疫组织化学标记、多种病原体（细菌、病毒 和支原体等）快速诊断，作为研究免疫复合物、膜抗 原、膜受体和膜IgG的固相吸附剂。本节主要介绍 SPA在免疫组织化学标记中的应用。SPA可被多种标 记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等所标 记，应用较广的为酶标SPA和金标记SPA技术。标记

当然，生物素结合的二抗必须是针对一抗种属的。因
此，SABC法较PAP法操作更简单、更灵敏。目前，SABC试 剂盒已经商品化，可以根据需要购买。
（四）PAP法与ABC法联合（ABPAP）技术

ABPAP使特异性一抗结合更多的酶分子，原始信号得 到更大的放大效应。 （1）石蜡切片脱蜡至水 （2）滴加0.3% H2O2，80%甲醇抑制内源性过氧化物酶

二、葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫组织化学技术 （一）SPA的生物学特性 1．生化特性 葡萄球菌蛋白A是一种从金黄色葡 萄球菌细胞壁分离的蛋白质，简称蛋白A（SPA）。SPA 存在于大部分（90%）金葡菌，并且主要存在于血浆凝 固酶阳性的菌株。内含3个高度相似的Fc段结合区，每 区有50个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。 SPA的羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定，其 黏度高于球蛋白，等电点PI=5.1，天然结构十分稳定， 在应用6mol/L鸟嘌呤盐酸盐变性剂条件下，尚能保存某 些三级结构，除去变性剂后，能自然矫正恢复原有结构。



（3）用0.1 胰蛋白酶室温消化10min
（4）滴加二抗的正常血清1:10；； （5）滴加适当稀释的一抗； （6）加适当稀释的标记二抗；
（7）滴加鼠PAP或兔PAP；
（8）生物素化马抗鼠或羊抗兔； （9）滴加ABC复合物； （10）滴加0.04%
DAB + 0.03% H2O2，
将过量凝集素加于组织切 片上（以保证凝集素的结 合位点被组织上的糖基不 完全占据）再加糖基化的 标记物（如岩藻糖基
Fuc-HRP)，其中的糖基 将结合于未被占据的凝集 素结合位点，然后显示标 记物。由于目前发现的糖 基化的标记物种类不多， 故夹层发的使用有限。
第五节
ห้องสมุดไป่ตู้
免疫金银及铁标记技术
应用胶体金作为标记物的免疫金染色和免疫 金银染色方法，在光镜和电镜下可以进行单标记、 双重标记或多重标记，观察组织和细胞结构，定
（一）凝集素的生物学特性
生物膜中含有一定的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形 式存在。凝集素能识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中复 杂的碳水化物结构，即细胞膜表面的碳水化物决定簇。一 种凝集素具有对某种特异性糖基专一性结合的能力，如刀 豆素与α -吡喃糖基甘露糖（α -D-mannopyranosyl）结合， 麦胚素与N-乙酰糖胺（N-acetyl glucosamine）结合。因 此，凝集素可以作为探针，研究细胞膜上特定的糖基。另 外，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、 胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显 示其结合部位
（3）加一抗血清覆盖切片，37℃孵育45 min （4）用Tris-HCl 缓冲液洗涤5min；
（5）滴加SPA室温处理30min， 缓冲液洗涤5min；
（6）加PAP复合物孵育30min， 缓冲液洗涤5min； （7）加DAB（0.6mg/ml）和0.01% H2O2室温显色 5min，蒸馏水漂洗； （8）苏木精复染1min，脱水、透明、封片，镜下观察 反应产物呈棕色
（6）用Tris-HCl 缓冲液洗涤5min×3次，DAB-H2O2室 温显色，蒸馏水漂洗；
（7）苏木精复染，脱水、透明、封片，镜下观察反应 产物呈棕色。
2．SPA用于PAP法染色
（1）石蜡切片脱蜡后用0.3% H2O2-80%纯甲醇液抑制 内源性过氧化物酶20min；
（2）加10%卵白蛋白Tris 缓冲液，室温作用20min；
（1）石蜡切片脱蜡后用0.3% H2O2-纯甲醇液处理20min， 抑制内源性过氧化物酶； （2）用凝集素室温孵育30min ，TBS洗涤3min×2次；
（3）加10μ g/ml HRP标记的糖液，室温孵育30 min， TBS洗涤5min×2次；
（4）DAB-H2O2显色，蒸馏水漂洗，脱水、透明、封片。
第四节

亲和免疫组织化学技术
20世纪70年代以来，随着免疫组织化学技术的广泛应用， 一些具有双价或多价结合力的物质如生物素、植物凝集素和 葡萄球菌蛋白A（SPA）等被应用于免疫组织化学技术。这 些方法的特点是以一种物质对某种组织成分具有高度亲和力 为基础，1976年Bayer首次称之为亲和组织化学。实际上， 抗原抗体反应本质上也属于亲和组织化学的范畴。目前，亲 和组织化学包括抗原与抗体，生物素与抗生物素，植物凝集 素和糖类，葡萄球菌蛋白A与IgG，阳离子与阴离子，激素、 维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。