薄层色谱法

4.点样过程 确定点样位置
吸取点样溶液
点样。
a.用铅笔在距薄层底边1.5-2.0cm处画一条起始线，在起始线上作 好记号作为点样位置，每个位置之间的距离为1.0-1.5cm； b.用点样设备吸取一定量的溶液； c.于点样位置上的吸附剂轻轻接触，点样设备内的溶液就会自动被 其吸附，形成直径最好为2-4mm的圆点或宽度为5-10mm的条带，完 成一次点样。 注意：若需要在同一个位置多次点样，则每点一次，应带溶剂挥干 后再点下一次，避免斑点扩散；当一块薄层板上需点几个样品时， 点样设备不能混用。
薄层板上的斑点位置确定之后，可对物质进 行定性鉴别、杂质检查和含量测定。
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第三节 在药物分析中的应用
主要用于中药、化学药物、生物制品等的定 性鉴别、杂质检查、含量测定。
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一、在鉴别方面的应用
通常采用对照物比较法进行定性鉴别。在保证 各斑点分离度达到标准的前提下，如果样品的 Rf与对照物的Rf相同，则可认为该组分与对照 物为同一物质。 为了结果的准确可靠，应采用多种不同的展开 系统进行展开，如果所得到的Rf都与对照品一 致，则可认定两者是同一物质。
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锯齿扫描
(1)单波长扫描：使用一种波长的光线对薄 层进行扫描。 (2)双波长扫描：是采用两种不同波长的光 束先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两 波长吸光度之差，可以消除薄层背景吸收的 干扰。
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化合物斑点的吸收光谱
单波长与双波长扫描曲线的比较
6.定量方法
2.仪器：光源、单色器、薄层板台、检测器、色谱工作站 3.测量方法：根据对光测定方式的不同，可分为三种
透射法：测量反射光的强度 反射法：测量透射光的强度
L 光源；MC 单色 器；P 薄层板； S 斑点； PD 光电 检测器
反射法扫描
透射法扫描
4.扫描方式
线性扫描、锯齿扫描 线性扫描：扫描速度快，但斑点性状不规则 和浓度不均匀时误差大，主要用于荧光扫描 法 锯齿扫描：斑点的吸光度积分值比线性扫描 大、重现性好，能消除浓度分布差异，适用 于形状不规则或分布不均匀的斑点，主要用 于吸收扫描法
液、碘、硫酸溶液等。
香草醛-浓硫酸主要用于高级醇、酚、甾体类及挥发油类物质的检出；
高锰酸钾水溶液主要用于不饱和化合物的检出；
碘对许多有机化合物都可显色，如含杂原子的生物碱、氨基酸等； 硫酸对大多数有机化合物也能显色。
2.专属性显色剂
指能使某一类或少数几类官能团或化合物显色的试剂。
异羟肟酸铁试剂是含内酯结构化合物的专用显色剂；
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二、在检查方面的应用
杂质检查多为限量检查，无需测定杂质的含量， 只要检查药物中的杂质是否超过限量。 杂质检查法可采用杂质对照品法、供试品溶液 的自身稀释对照法或杂质对照品与供试品溶液 的自身稀释对照法并用。
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1.杂质对照法 取浓度已知的杂质对照品溶液 和制备好的供试品溶液，分别点于同一薄层板 上，经过展开和斑点定位后，观察供试品中所 含杂质的斑点。除主斑点外的其他斑点应与相 应的对照品溶液或系列浓度对照品溶液的主斑 点比较，不得更深。 前提是有杂质对照品。
可保证杂质检查的准确性。
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三、在含量测定方面的应用
（一）目视比较法 是一种较粗略的含量测定法。 将组分对照品配制成一系列浓度已知的标准溶 液，与供试品一起点于同一块薄层板上，经展 开定位后，比较供试品中斑点的大小及颜色深 浅或荧光强弱于对照品中哪一个最接近，即可 求得供试品中组分含量的近似值。
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四.TLC流动相
（一） 流动相的选择依据 “相似相溶” 极性大的组分选用极性大的展开剂分离 极性小的组分选择极性小的展开剂分离
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（二） 流动相的选择方法 展开剂的选择一般从常用的溶剂开始，然后根据被 分离组分在薄层板上的分离效果，进一步考虑通过 改变展开剂的极性或采取混合溶剂来达到满意的分 离效果。 对于结构差异较小或物质极性接近的难分离组分， 采用二元、三元甚至多元溶剂做展开剂效果好。 对于具有酸碱性的物质来说，可在展开剂中加入一 定量的酸或碱调节pH，以获得满意的分离效果。
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1.基本原理
根据薄层扫描的测定方式，分为薄层吸收扫描法和薄层荧 光扫描法。 （1）薄层吸收扫描法 展开后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸 光度的变化，得到扫描曲线。 由于薄层板存在明显的散射现象，斑点中物质的浓度与吸 收度的关系需用Kubelka-Munk理论及曲线来描述。 （2）薄层荧光扫描法 化合物本身有荧光或经过适当处理后生成荧光化合物者可 测量其荧光强度而进行定量。
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3.展开操作方法
a.根据实际情况选择合适的展开缸
b.展开缸预先用展开剂饱和 c.将点好样的薄层板放入展开缸的展开剂中 d.待薄层板展开至规定距离后，取出薄层板，晾干
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4.展开注意事项
a.原点不能浸入展开剂中
b.展开时展开剂蒸汽应达到饱和 c.展开缸的密封性要好
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四、斑点定位
展开完毕后，把薄层从层析缸中取出，用铅笔划出 或小针刺出展开剂前缘的位置，随即进行显色，以确定 各个斑点的位置、Rf值和显色情况，从而判断试样中含 有哪些组分。
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（二）斑点洗脱法 将已定位的斑点连同吸附剂一起从薄板上刮下， 再用适当的溶剂将斑点中的组分洗脱下来，以 比色法、分光光度法等测定含量。 由于组分在吸附剂上不能完全被洗脱而导致回 收率较低。
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（三）薄层扫描法 将一定波长的光照射在薄层板上，对供试品中 能吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能 产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱 及积分数据用于药物的鉴别、检查和含量测定。
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2.自身稀释对照法 将制备好的供试品溶液按 限量要求稀释至一定浓度作为对照溶液，再与 供试品溶液分别点于同一薄层板上，展开，定 位，供试品溶液中除主斑点外的其他斑点应与 自身稀释溶液的主斑点比较，不得更深。 可弥补杂质对照品法的缺陷。
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3.两法并用 在同一薄层板上，分别点上供试 品溶液、杂质对照品溶液以及供试品的自身稀 释对照溶液，展开定位后进行观察。
常用的薄层色谱法以吸附剂为固定相,属于吸附色谱的范畴
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特点
薄层色谱与液相色谱法比较
HPLC
每次只能分析一个样品
TLC
在一块板上点上多个样品 同时进行分离
对样品制备要求高，必须不 用毕一次弃去，可直接用 含可吸留在柱上的杂质，否 样品的粗提物点样 则柱性能受损 可用检测器种类较少 展开后可用多种手段检测
外标法、内标法、回归曲线法 外标法： 供试品与标准品交叉点在同一块板上，供 试品点样不少于4个，每一个浓度对照品不少 于2个，调整标准溶液的浓度或供试品与标准 溶液的点样量，使其峰面积接近，点样必须 准确，宜用定量毛细管点样。
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内标法： 选用一个物质作为内标物，并准确称取一定 量内标物加到供试液及标准液中，计算供试品溶 液中某组分含量的定量方法。 对于复杂样品，不易找到适宜Rf的纯品内标 物，且溶液配制等操作较麻烦，所以实际工 作中主要采用外标法。
相对比移值，即相对于某一物质x的Rf值，用Rx 表示。 其定义为：Rx＝组分的Rf值／物质x的Rf值 组分A相对于物质B的“相对比移值” RB =a/b
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三.TLC固定相
（一） 对吸附剂的要求 有足够大的表面积及足够的吸附力 对不同组分的吸附具有较好的选择性 不与流动相作用，质量稳定，颗粒均匀
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（一）干法制备软板
定义：采用干法在吸附剂中不加含粘合剂而 制成的薄层板称为软板。 操作：吸附剂撒在玻璃板一端 玻璃棒两 端套上塑料管或胶管 玻璃棒从撒有吸附 剂的一端向前推动 特点：操作简便、快速，但是不牢固、容易 吹散、吸附剂容易脱落、展开后不能保存、 斑点扩散严重、分离效果较差。
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二、点 样
1.样品溶剂 要求溶剂易挥发，点样斑点不容易扩散。一般 用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂，避 免使用水作溶剂。 2.点样设备 毛细管、微量注射器、定量毛细管、微量吸管、 自动点样仪、半自动点样仪。 3.点样量 点样量的多少与展开结果直接相关，过大会造 成斑点拖尾，过小会得不到清晰的斑点，常用量为 几至几十µg，制备型的分离可以点样到mg量。总之 点样量随分离目的而定。
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薄层色谱特点
(1)快速(数十秒~数十分钟) (2)分离效率高(多柱路) (3)灵敏度高
(斑点扩散小,比纸色谱高10-100倍)
(4)专属性强 (5)选择性好 (6)操作简便、设备简单
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二. 基本参数
比移值（Rf） Rf =原点至组分点中心的距离/原 点至流动前沿的距离 组分A的Rf =a/c 组分B的Rf =b/c
第八章 薄 层 色 谱 法
（Thin-layer Chromatography，TLC）
目
录
一 基本原理 二 操作方法 三 在药物分析中的应用
第一节 基本原理
一、定义: 继柱色谱和纸色谱之后发展起来的方法
薄层色谱法通常指以吸附剂为固定相的一种液相 色谱法。即将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁 的表面上均匀地铺成薄层，试样点在薄层的一端， 流动相携带样品往前移动，经过一定时间，可在 薄层板上形成互相分离的多个斑点，根据斑点的 位置与颜色深度进行分析。
三、展 开
1. 展开装置
2. 展开方式 3. 展开操作方法 4. 展开注意事项
1.展开装置
长方型展开槽 直立型展开槽
2.展开方式
(1)近水平展开：将点样后的薄层板下端浸入展 开剂0.5cm，薄层上端垫高使薄层与水平成 15-30º 的角。 (2)上行展开：将点样后的薄层放在盛有展开剂 的直立型的展开槽中，展开剂由薄层下端借 毛细管作用上升至前沿。 (3)多次展开 (4)双向展开
碘化铋钾是生物碱类化合物的专用显色剂；
茚三酮是氨基酸的专用显色剂；
斐林试剂是还原性糖的专用显色剂。
（二）荧光定位
在紫外光灯的照射下观察薄层板上有无荧光斑点或暗斑。
本身能发出荧光的物质可直接在紫外光灯下观察荧光斑
点；本身不能发出荧光的物质可与一定试剂反应生成具
有荧光的物质再在紫外光灯下观察。
五、结果分析
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第二节 操作方法
制板 点样 展开 定位与显色 结果分析
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一、制板
含义：将吸附剂涂布在支持物上制成一厚度均匀薄层的过程。 制板的支持物通常用玻璃板，要求表面光洁、平整无油污，具有 一定的机械强度，能经受一定的高温，对所用溶剂和显色剂呈化 学惰性。 规格： 5cm × 20cm ， 10cm × 10cm ， 10cm × 20cm ， 20cm×20cm等。 制法：干法、湿法。
有色物质经展开后呈现明显的色斑，很易判断。 对于无色物质，可根据化合物的性质，用以下方法 进行定位。
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（一）显色定位
显色定位是在薄层上使用一种或数种化 学试剂与被检出物质反应，生成有颜色的化 合物而定位。这种试剂叫显色剂。
显色剂一般分为两类，即通用显色剂和 专属性显色剂。
1.通用显色剂
常用的通用显色剂有：香草醛-浓硫酸、高锰酸钾水溶
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（二） 吸附剂的种类 常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤 维素、聚酰胺等。 吸附剂的种类不同，可分离、分析的物质也 不尽相同。
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（三） 吸附剂的选择原则 吸附剂的选择：主要决定于样品成分的性质，即 它们的溶解性、酸碱性、极性以及是否与吸附剂 起化学反应等。 弱酸性试样宜选择硅胶、酸性或中性氧化铝； 试样无色无荧光，选择添加无机荧光剂的硅胶 极性小的试样选择吸附活性强的吸附剂 极性大的试样选择活性较弱的吸附剂
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（二）湿法制备硬板
定义：在吸附剂中加入粘合剂所制成的薄层 板称为硬板。 操作：吸附剂与粘合剂按照1:3比例置于研 钵中研磨 制板 自然阴干 放烘箱活化 使用之前检视
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1.倾注法：将已调成糊状并去除气泡的吸附 剂倾倒在玻璃板上，用玻璃棒均匀摊开，然 后轻轻振荡，使薄层均匀即可。
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2.平铺法：在水平台上放置玻璃平板，将准 备好的薄层用玻璃板置于此板上，在玻璃板 两边加上玻璃条制成框边，将已调成糊状并 去除气泡的吸附剂倒在中间玻璃板，用玻璃 棒向一定方向均匀地将吸附剂刮平，最后去 掉边玻璃框，逐块将薄层板轻轻振荡均匀。
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3.机械涂铺法：涂铺器中安装有一盛装吸附 剂的槽，当槽移动时，吸附剂便从其出口流 出，均匀涂铺在玻璃板上。