马铃薯细胞培养

任务三 马铃薯细胞悬浮培养
• 细胞悬浮培养是使离体又保持良好分散状态的单个细 胞或小细胞团置于液体培养基中，放置在摇床上进行 培养的方法。
• 一、细胞悬浮培养的类型
• 按细胞培养过程一般将细胞培养分为成批培养和连续 培养两种类型。
• （一）成批培养
• 成批培养是指在固定培养基体积的容器系统中进行的培养。
• 要从完整的植物器官中直接分离单细胞，通常采用机械法和酶 解法。
• 在实际细胞培养中，常用分散性较好的愈伤组织来制备单细胞。
任务二 马铃薯单细胞培养
• 一、单细胞培养方法
• 在单细胞培养中常用的基本方法有平板培养、微室培养和 看护培养。
• （一）看护培养
• 看护培养是指用Fra Baidu bibliotek块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞， 并使其生长和增殖的方法。这个愈伤组织称为看护愈伤组 织。
• 根据培养基在容器中运动方式可以分为四种方法：
• 一是旋转培养法，培养瓶呈360°的缓慢旋转移动，使细 胞培养物保持均匀分布和保证空气供应，一般采用1～5 r/min。
• 二是往返振荡培养，机器带动培养瓶在一直线上往返振荡。
• 三是旋转振荡培养，机器带动培养瓶在平面上作旋转振荡， 40～120 次/min。
• 在用细胞悬浮培养物进行单细胞分离研究时，发现瓶壁法是一 种最好的细胞悬浮液继代方法，可直接获得90％的单细胞频率， 且细胞形状圆、胞质浓厚。
• 采用过滤法分离单细胞，可得到98％的单细胞频率；三层细胞 筛过滤法可有效提高所得单细胞的植板率。
• 过滤细胞悬浮培养物的物理操作方法获得的单细胞比酶解法获 得的单细胞分裂能力更强。
• 植板率 = 每个平板中形成的细胞团数 / 每个平板接种的细胞数×100%
• 一般悬浮培养液要达到最终要求植板密度的2倍，平板培养产物 的密度要求为1×103～1×105个，悬浮培养液应该在2×103～ 2×105，过高或过低都不利于培养。
• 二、马铃薯单细胞培养
• 以马铃薯栽培品种的无菌苗、子叶以及已建立的细胞悬浮培养 系为材料，分别用酶解法和过滤细胞悬浮培养系的物理方法进 行了马铃薯单细胞分离技术的研究。结果表明，酶解时，果胶 酶浓度为0.20％～0.25％，解离4h获得的单细胞产量最高，且单 细胞分裂频率可达16％以上。
• 具体方法介绍。
图9-1 应用看护培养法建立单细胞无性系
A. 一个置于滤纸上的单细胞，滤纸铺在一大块愈伤组织（看护培养）的顶上； B. 培养的细胞分裂形成一个小细胞团； C. 在由滤纸上转移到培养基上进行直接培养之后，由单细胞起源的细胞团已长成一大块愈伤组织。
• （二）微室培养法
• 微室培养是利用人工制备的微室来培养单细胞的方法。 首先要制备用于单细胞培养的微室，用酒精灯灼烧洗净 的盖玻片和载薄片，冷却后，从悬浮培养物中取出一滴 含单细胞的培养液，置于载玻片上，在培养液的四周并 隔一定距离涂上一圈石蜡油，然后在其两侧隔加一滴石 蜡油并分别放置一张盖玻片，再用一张盖玻片架在前两 张盖玻片之间，这样一滴含有单细胞的培养液就被放于 微室中。
• 1.成批培养的特点
• 成批培养由于细胞培养在固定体积的培养基上，细胞增长 会发生规律性的变化，及由培养初期的延缓期发生的较慢 生长到中期对数生长期的快速生长，再倒减慢期的减慢生 长，最后在静止期细胞停止生长，直至开始死亡。
• 成批培养的细胞若要进行下一批培养，必须另外进行继代 培养。
• 2. 成批培养的分类
• 2.连续培养的分类
• （1）半连续培养
• 半连续培养指每隔一定时间后倒出一定量的悬浮液，并同 时补充加入等量的新鲜培养基，这相当于成批培养时频繁 进行再培养，半连续培养能重复取得大量、均一的培养细 胞，共生物研究之用。
• （2）连续培养
• 连续培养有封闭式和开放式连续培养之分。
• 封闭式连续培养是指用等量的新鲜培养基换出老培养基， 并把排出的细胞收集后再放入系统中继续培养，所以系统 中细胞数目不断增加。
• 四是搅动培养，利用搅棒的不断转动搅拌培养基。
• （二）连续培养
• 连续培养是指在培养过程中，不断抽取培养物并注入 等量的新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保 持其恒定体积的培养。
• 1.连续培养的特点
• 该方法由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的供应， 不会发生营养不足的现象，可以使培养的细胞保持在 对数生长期快速生长，适于大规模工业化生产。
• 开放式连续培养是指在连续培养期间，新鲜培养基的注入 速度等于细胞悬浮液的排出速度，细胞也随一起排出，当 细胞生长到稳定状态时，系统中增加的细胞数等于流出的 细胞数，因而培养系统中细胞密度保持恒定。
项目九
马铃薯细胞培养
• 知识目标
• 1.了解细胞培养的理论知识； • 2.了解细胞培养的方法和发展前景。
• 技能目标
• 掌握细胞培养的一般程序和必要的理论知识。
任务一 马铃薯单细胞的分离
• 自1902年，Haberlandt提出分离单个细胞并把它培养成植株的 设想以来，随着组织培养技术的发展，已在细胞培养领域的研 究取得了巨大进展。人们不仅能够分离和培养游离的细胞，还 能使高等植物的单个细胞在离体培养条件下，通过诱发细胞分 裂形成细胞团，再分化成完整的植株，并建立了细胞培养的多 种专门技术。
• （三）平板培养
• 平板培养法是把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平 铺一薄层在培养皿底上的培养方法。将含有游离单细胞的悬浮 培养物过滤，除去组织块和大的细胞团。
• 在低倍显微镜下观察计算每只培养皿中出现的细胞团的数目， 由此计算植板率。
• 植板率是指已经形成细胞团的单细胞数与接种总细胞数的百分 数。公式为：
• 三、影响单细胞培养的因子
• 初始植板密度和培养基的成分是单细胞培养成败的关键因子，两 者互相依赖。单细胞培养要求植板的细胞有一个标准临界密度才 能促进细胞分裂和发育。低于此临界密度细胞不能进行分裂和形 成细胞团。
• 在选择细胞时，注意要选用胚性细胞或分裂细胞，不要选择静止 期细胞。
• 利用生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基来培养单细胞，利 于单细胞的分裂和生长，主要是由于愈伤组织或单细胞在生长过 程中向培养基释放了能促进细胞分裂的一些特殊代谢物，使这种 培养基营养更加丰富，从而有利于单细胞进行生长和分裂。