诱导多能干细胞

诱导多能干细胞：过去，现在和未来
介绍
在2006年，我们发现，干细胞与胚胎干细胞相似的属性，可以同时引入四种基因（高桥和Yamanaka，2006年）从小鼠成纤维细胞产生。

我们指定了这些细胞的iPS细胞。

在2007年，我们报道了类似的方法适用于人类成纤维细胞，并通过因素引入了一把，人类iPS细胞可以生成（Takahashi等，2007）。

就在同一天，詹姆斯·汤姆森的研究小组还报告了人类iPS细胞的生成，使用不同组合的因素（Yu等人，2007）。

合并三个科学流LED iPSCs的生产
像任何其他科学的进步，过去和现在的科学家在相关领域众多研究结果的基础上，建立了IPSC的技术。

有三个主要的数据流的研究导致我们生产的iPS细胞（图1）。

第一个数据流进行重新编程核移植。

1962年，约翰·格登报道，他的实验室已经收到了成年青蛙肠细胞的细胞核（格登，1962）的未受精的卵子产生的蝌蚪。

超过三十年后，伊恩·威尔莫特及其同事报道多莉诞生的第一只哺乳动物体细胞克隆产生的乳腺上皮细胞（威尔莫特等人，1997）。

在这些成功的体细胞克隆显示出，即使是分化的细胞中含有的所有的发展所需要的整个生物体的遗传信息，而卵母细胞包含体细胞核重新编程的因素，可以。

2001年，田田隆的研究小组发现，胚胎干细胞也含有因素，可以重编程体细胞（田田等人，2001）。

第二个流是“大师”的转录因子的发现。

在1987年，果蝇的转录因子，触角，异位表达时（Schneuwly等人，1987）表明，诱导形成的腿代替触角。

在同一年，哺乳动物转录因子，调节因子MyoD ，显示转换成纤维细胞，成肌细胞（Davis等人，1987）。

这些结果导致“主调节器，”一个给定的血统的命运决定和诱导的转录因子的概念。

许多研究人员开始寻找各种谱系单主监管。

尝试失败，也有少数例外（Yamanaka和布劳，2010）。

第三，同样重要的是，流是涉及胚胎干细胞的研究。

自第一代在1981年小鼠胚胎干细胞（埃文斯和考夫曼，1981年，1981年，马丁），奥斯汀·史密斯和其他人已经建立了培养条件，使长期维持多能性（史密斯等人，1988）。

维持小鼠胚胎干细胞的一个关键因素是白血病抑制因子（LIF ）。

同样地，由于第一代的人胚胎干细胞（Thomson等人，1998年），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF ）的最佳培养条件已经成立。

组合第一两个流的研究使我们假设，这是在卵母细胞或胚胎干细胞，体细胞重新编程到胚胎状态，设计实验，以确定该组合的多个因素的组合。

使用信息所需要的文化多能干细胞的培养条件，我们就能够识别四个因素可以产生iPS细胞。

IPSC的技术成熟和理解
后不久，其他各组小鼠iPSCs的初次报告，概括了基于因子重编程的小鼠（Maherali等，2007年，Wernig等人，2007）和人类（Lowry等，2008年，公园等。

2008B ）。

iPS细胞技术的优点之一是它的简单性和重现性。

许多实验室开始探索相关机制和修改程序。

尽管iPSCs的重复性，可以生成过程中的效率仍然很低，通常小于1 ％转成纤维细胞成为iPS细胞。

最初这种低效率的提高iPS细胞的可能性，来自罕见的干或者未分化的细胞，成纤维细胞培养共存（山，2009A ）。

然而，随后的研究表明，iPS细胞可以是来自于终末分化的淋巴细胞（罗等人，2009）和有丝分裂后的神经元（Kim等人，2011a的）。

因此，大部分的，如果不是全部，体细胞有可能成为iPS细胞，尽管有不同的效率。

怎能只是一小部分因素诱导体细胞重编程？这是超出了本文的范围，提供一个概述的许多研究已经解决了这个重要的问题。

从我的角度来看，许多科学家的共识似乎是重编程因子的启动重编程过程中有更多的不到1％的转染细胞，但该过程没有完成在大多数细胞中。

知之甚少的随机事件似乎需要完全重新编程的地方（Hanna等人，2009年，山中伸弥，2009年a）。

正如我在下面的讨论，培养条件似乎为动力，可以帮助促进全重编程功能。

最初的iPSCs可以使用逆转录病毒或慢病毒，这可能会造成插入突变，从而会带来风险转化
应用，甚至可以造成不利影响，如看到那些在基因治疗（Hacein - BEY- Abina等一些尝试。

，2003）。

来自逆转录病毒衍生的iPS细胞的小鼠，显然是正常的，，只要c-Myc的基因表达被压抑（葵等，2008年，中川等人，2008年）。

然而，人类iPSCs的长期安全性不能保证通过小鼠研究孤单。

此外，逆转录病毒可能使，iPSCs的免疫原性（Zhao等，2011年）。

因此，对于细胞移植治疗的目的，我们将需要避免涉及载体整合到宿主基因组的诱导方法。

已经报道了许多方法来产生整合的iPSCs 。

这些方法包括质粒（冲田等人，2011A ，冲田等人，2008），仙台病毒（Fusaki等，2009），腺病毒（Stadtfeld等人，2008），合成的RNA （Warren等。

，2010 ）和蛋白质（Kim等，2009）。

此外，已经尝试通过小分子诱导重新编程。

其中，质粒和仙台病毒经常使用的许多实验室。

在诱导多能干细胞（iPS 细胞）的研究与应用，京都大学的中心，我们看好的方法是使用游离质粒在体外研究为再生医学和两种逆转录病毒或游离质粒。

我们宁愿这些方法，因为他们的简单和可重复性。

科学家们现在在很大程度上改变他们的努力从技术本身的发展应用。

IPSC的技术已经出现新的科学流
在科学上从来没有停止流动（图2）。

小鼠实验室鲁道夫詹尼士的（汉纳等人，2007 ）的开创性工作后，科学家们现在做的进展对使用iPS细胞在再生医学，例如治疗帕金森氏病（Kriks等人，2011 ），血小板缺乏症（高山等人，2010）脊髓损伤（紫菜等，2011年，Tsuji等人，2010），和黄斑变性（冈本和高桥，2011）。

患者来源的iPS细胞已被证明是有用的建模疾病和筛选的候选药物的图书馆。

从开创性研究由乔治·戴利（Park 等人，2008年a ）领导组，和凯文·埃根（DIMOS等，2008），发表超过100份报告在过去三年中使用特定疾病的iPS细胞。

我是惊讶，特定病人的iPS细胞可以被用来复述表型不仅单基因疾病，但也迟发性多基因遗传性疾病，如帕金森氏病（迪瓦恩等人，2011 ），阿尔茨海默氏病（以色列等。

，2012 ，Yagi等，2011年，八幡等，2011），精神分裂症（布雷南德等，2011）。

兴奋包围这些细胞的应用潜力，同时分析疾病的机制和调查潜在的新的治疗方法。

体细胞是来自于iPS细胞，特别是心肌细胞和肝细胞，也可以被用于毒物学测试作为替代现有的方法（山中，2009年b）。

此外，这些医疗应用，iPS细胞可用于在动物生物技术。

猴（Liu等人，2008），猪（West 等，2011）和犬（Shimada等人，2010年）的iPS细胞可用于基因工程在这些动物中，使产生的疾病模型和生产有用的物质，如酶，遗传性疾病的患者缺乏较大的动物。

在未来潜在的技术可能是有用的，用于保护濒危动物（奔嫩等人，2011年），虽然很多挑战需要克服。

其中最引人注目的应用程序的iPSCs的报道中内和他的同事们，谁产生了大鼠胰腺在小鼠，大鼠iPS细胞通过显微注射到小鼠囊胚（小林等人，2010年）胰腺发育至关重要的基因缺陷。

在将来，可能会成为可能生成人体移植的器官，使用了类似的策略。

IPSC的技术从出现的另一个科学流是“直接重新编程”从一个躯体传承到另一个。

正如上面所提到的，试图确定一个单一的“大师”的转录因子已经失败大多数体细胞谱系。

然而，在iPS细胞重编程的成功，科学家们转而寻找一个单一的因素，寻找结合。

梅尔顿和他的同事报道了小鼠胰腺内分泌细胞的外分泌细胞转化，使用相结合的三种转录因子（Zhou 等，2008）。

他们的开创性工作，不久之后，各种体细胞，如神经细胞（Vierbuchen等人，2010年），肝（Huang等，2011年），心肌细胞（家田等转换成纤维细胞在体外的例子很多。

2010年）和造血祖细胞（萨博等人，2010年）。

直接重新编程简单，快速。

剩下的一个障碍是如何获得足够量的靶细胞用于下游应用。

这个新的技术，最好的用法，可在现场直接重新编程（Qian等，2012 ）。

大问题：iPS细胞与胚胎干细胞不同？
关于iPS细胞的最重要的问题之一是他们是否是从胚胎干细胞不同，如果是这样，不存在任何差异，是否是功能相关的。

iPSCs的研究过程中的最初几年中，我们惊奇的胚胎干细胞
非常相似。

然而，从2009年开始，科学家开始报告iPS细胞和胚胎干细胞之间的差异。

例如，Chin等人，2009年比较了三种人类胚胎线和五个iPSC的线的表达芯片，并确定了数百个基因的差异表达（Chin等人，2009）。

他们的结论是iPS细胞应被认为是独特的多能干细胞亚型。

两个其他的研究还比较了全球ESCs和iPSCs和确定持久的供体细胞的基因表达的iPS细胞（Ghosh等人，2010年，马尔凯托等，2009年）之间的基因表达。

这是邓小平等人，2009年首次报道有两种类型的多能干细胞系的DNA甲基化之间的差异后，他们进行了有针对性的亚硫酸氢盐测序三个人类胚胎克隆和四个iPSCs的线。

土井等人，2009年还报道有差异甲基化基因，如BMP3 ，胚胎干细胞和iPS细胞之间。

随后，三个研究报告供体细胞的表观遗传记忆人类诱导多能干细胞（Kim等，2011B ，李斯特等人，2011年，大井等人，2011年）。

然而，其他研究得出的结论，这是很难区分iPSCs的胚胎干细胞的基因表达或DNA甲基化。

两份报告显示IPSC的克隆和ESC克隆重叠的基因表达的变化，因此这两种类型的多能干细胞聚集在一起，通过这些分析（冈瑟等，2010年，纽曼和库珀，2010）。

他们认为，这些变化，至少在一部分，是来自于每个实验室所使用的不同的诱导和培养条件。

博克等人，2011表明iPS细胞和胚胎干细胞中的基因表达和DNA甲基化是非常相似的，一些iPS细胞克隆不能区分从胚胎干细胞。

通过检查多少的iPS和ES克隆进行比较，我们观察到一个明显的趋势（见表1）。

研究报告的差异无论是在基因表达或DNA甲基化相比数量相对较少（一般少于10 ），各组），而那些发现很难区分从胚胎干细胞的iPS细胞多克隆和克隆分析来自多个实验室。

一直讨论的另一个主要点的能力的细胞分化和iPS细胞是否在功能上是不同的胚胎干细胞（在这方面）。

胡锦涛等人，2010年在体外定向神经分化的五个人类胚胎克隆和12个iPS 细胞克隆。

他们发现，所有的ESC克隆分化成PAX6的阳性细胞，90％以上的疗效，但iPS 细胞克隆表明分化较差，约10％至50 ％的疗效。

然而，博尔廷等人，2011年检查了16人的iPSC克隆他们的能力，分化成运动神经元，并发现有13个，这些iPS细胞克隆胚胎干细胞相媲美的功效区别。

所以，再有矛盾的结论，关于iPS细胞和胚胎干细胞之间的相似性。

总而言之，这些研究表明，iPS细胞克隆和ESC克隆的重叠度的变化（图3）。

应该指出的是ESC克隆之间的变化已经充分地记录（长船等，2008年，Ward等，2004年）。

虽然这是可能的iPS细胞克隆表现出更大的变化，一些克隆不同的胚胎干细胞中的基因表达，DNA甲基化，或分化能力（Miura等，2009），它显示，至少有一些是无法区分的iPS 细胞克隆从ESC克隆。

有趣的是，考虑的iPSC克隆之间的这种变化带来了什么。

我们学到的重要一课，从两个相关的报告，关于小鼠iPS细胞（凯里等人，2011年，Stadtfeld等人，2010）。

这两项研究，在Hochedlinger实验室和詹尼士的实验室进行，使用非常相似的的二次感应系统生成小鼠iPSCs的。

然而，iPS细胞克隆的属性是非常不同的两个实验室之间。

产生的iPS细胞克隆在Hochedlinger实验室大多不能成功地用于，到产生生殖主管的嵌合体显微注射或“iPSC 的”小鼠的的四倍体互补性，最严格的标准来评估的多能性。

他们发现，DLK1 -DIO3基因的集群印迹的损失预测这些iPSC的能力较差。

形成鲜明对比的是，大部分的iPS细胞克隆产生在詹尼士实验室的正常印记DL1- Dios3的集群，能够产生高品质的嵌合体和可行的iPSC的小鼠。

两个实验室的方法，唯一显着区别的重编程因子的表达盒中的顺序，这种差异导致了较高的表达水平产生由詹尼士实验室在细胞中Oct4和Klf4 。

通过增加中Oct4和Klf4 （凯里等人，2011）的表达，或通过补充抗坏血酸（施塔特费尔德等人，2012），否则非常相似的方法所产生的iPS细胞的质量提高。

因此，水平和化学计量学的重编程因子，以及培养条件下，在iPSC的一代可以有助于显着的变化看出，在表观遗传修饰状态和所产生的iPS细
胞的多能干潜力。

这些数据表明，不完整或不完善的重新编程，是不是一个根本的问题与iPSCs的。

相反，在iPS细胞克隆的质量差异似乎在很大程度上是由于技术的变量，如因子的优化组合，基因的发送方法，和培养条件。

此外，iPS细胞克隆之间的一些变化可以归因于在重编程过程中，不能被控制的随机事件。

因此，评价和选择将是确定的iPSC克隆，适合医疗应用至关重要。

是否有“阴暗面”诱导多能性？
几份报告提出，除了在基因表达，DNA甲基化和多能性的潜力的变化外，还有其他潜在的iPS细胞中的异常，包括体细胞突变（戈尔等人，2011），拷贝数变异（Hussein等。

2011年），和免疫原性（Zhao等，2011年）。

在这些报告，iPSCs的消极方面是，在我看来，夸大了。

媒体反应过度，也伴随着科学的评论与它们的标题中的惊人之语，如“黑暗的一面，”攻击“下，”缺陷“，”麻烦“和”成长的烦恼“（2011年，APOSTOLOU和Hochedlinger Dolgin 2011年，海登，2011年，佩拉，2011年，Zwaka ，2010）。

然而，尽管这些末日标题，随后的分析表明，在iPS细胞中发现的许多遗传差异似乎已经预先存在于原来的体细胞，因此，产生独立的重编程过程本身（Cheng等人，2012，杨等，2012）。

本质上是重新编程，以形成iPS细胞克隆，因此，存在在低频率范围内的起始细胞种群的变化可以从它派生的单个克隆进行分析和比较它们的亲本细胞的人口作为一个整体时，变得更加显而易见。

另一项研究表明，很少有一组，有能力产生iPSC的小鼠的iPS细胞克隆遗传变异相对其亲本细胞（昆兰等，2011）。

来自没有Myc基因的转基因的iPS细胞的嵌合子代小鼠出现是正常的，表明这些iPS细胞不含有有害的遗传改变的功能产生负面影响（Nakagawa等人，2008年，中川等人。

2010）。

随着免疫原性方面，目前尚不清楚是否无转基因的iPS细胞的免疫反应弱显着性意义（大北等，2011B ），因为细胞的免疫原性，最突出的研究报告审查未分化的iPS细胞（赵等。

，2011），这将永远不会被用于细胞移植治疗。

我们必须明白所有这些结果，并认为他们的背景有一个平衡的观点，iPSCs的。

为什么ESCs和iPSCs的那么惊人的相似吗？
虽然iPS细胞和胚胎干细胞之间可能会有一些差异，他们是，尽管如此，非常相似。

如果有的话，我们或许应该知道为什么iPS细胞和胚胎干细胞实际上是如此的相似，尽管他们不同的起源和生成方法。

没有其他的例子，这种级别的人造细胞和天然存在的细胞之间的相似性存在。

几种类型的体细胞，如神经细胞和心肌细胞中，已经从胚胎干细胞/ iPS细胞或直接从成纤维细胞产生。

这些人造的体细胞有一些对应的正常体内存在的特性，但它们仍然是非常不同于天然的神经细胞和心肌细胞。

胚胎干细胞和iPS细胞之间的相似性，因此在许多方面例外。

一个可能的解释是，胚胎干细胞其实也是人祸。

这是可能的，胚胎干细胞不存在的生理条件下，而不是在特定的培养条件下培养的内细胞团（ICM ）细胞的选择和建立。

胚胎干细胞是从大多数细胞在ICM在许多方面有所不同。

例如，虽然具有全球DNA甲基化程度低的（Reik等人，2001）中的ICM细胞，胚胎干细胞有较高的甲基化程度（Li等人，1992）。

一个RAS家族基因，目前，在小鼠胚胎干细胞中高度表达，但在胚胎（Takahashi等，2003）。

胚胎干细胞也有较长的端粒比见于胚胎（瓦雷拉等，2011）。

因此，我们可能要讨论的两种类型的人造细胞，而不是人造细胞和自然存在的细胞之间的关系。

经过许多研究人员的努力，本场已建立的培养条件，使小鼠和人胚胎干细胞的产生和长期维护。

这很可能是这些文化条件选择具有某种特性的细胞，这种选择也将有助于使显示为类似胚胎干细胞和iPS细胞，因为他们做。

总结思考
如果我们接受的想法，胚胎干细胞和iPS细胞都是在实验室产生的人造细胞类型，我们移动
到另一个重要问题：做胚胎干细胞真正代表最终控制或iPSCs的金标准？我认为答案可能是否定的。

相反，未来的研究应该集中起来，形成新的组织，器官和模式生物的iPSCs的能力，作为一个流平行存在的胚胎干细胞相同的整体实验河的一个分支。

我相信，IPSC的技术现在已准备好许多应用，包括干细胞疗法。

从每个感应过程中，出现了多个iPS细胞克隆的各种品质的（图3）。

因此，必须选择良好的医疗应用克隆。

我们也许可以缩小候选人良好标记基因表达克隆。

但是，我们必须确认在体外分化倾向和基因组和表观基因组的完整性。

对于广泛使用，它可能是必要建立提前合格的iPSC克隆，健康志愿者或脐带血股股票。

可降低免疫排斥产生iPS细胞HLA纯合子捐助者（冲田等，2011a 的）。

IPSC的技术，将可能有一个实质性的影响，不仅在商业和政治上的科学，但也。

然而，iPSCs 的应基于严格的科学数据进行评估，所有这些数据，应充分考虑其相关的细胞的潜在临床应用。

要着重研究科学家，政治家和企业要依靠科学研究产生确凿的证据，告知未来的发展方向，而不是那些并不完全了解该领域的意见。