第四章 基因工程载体
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基因工程载体
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基因诊断
利用基因工程载体携带特定的检测基因或标记物， 对疾病相关基因进行快速、灵敏的检测和诊断。
应用领域与前景
农业生产
通过基因工程载体将优良性状基因导入农作物或家畜家禽的 基因组中，改良品种性状，提高产量和品质。
前景
随着科学技术的不断进步和创新，基因工程载体的研究和应 用将更加深入和广泛。未来，基因工程载体有望在个性化医 疗、精准农业、生物安全等领域发挥更大的作用，为人类健 康和生活质量的提高做出更大的贡献。
人工染色体载体
概念
人工染色体载体是一种基于天然染色体结构设计的基因工程载体，可模拟天然染色体的功 能和特性。
优点
人工染色体载体具有较大的容量，可容纳多个外源基因和调控元件。此外，人工染色体载 体还具有稳定的遗传特性和较低的免疫原性，可实现外源基因的长期稳定表达和遗传。
缺点
人工染色体载体的构建和操作相对复杂，技术难度较大，且成本较高。目前主要应用于基 础研究和临床试验阶段。
潜在生态风险分析
基因污染
基因工程载体可能通过水平基因转移等方式，将外源基因 导入非目标生物体内，造成基因污染。
生态平衡破坏
外源基因的导入可能对目标生物及其相关生物种群的生态 平衡产生不良影响，如改变种间竞争关系、影响食物链等。
生物多样性减少
基因工程载体的广泛应用可能导致生物多样性减少，特别 是对一些濒危物种和生态系统的影响更为显著。
人类健康影响评估
食品安全问题
基因工程载体在食品生产中的应用，如转基因作物，可能对人体健 康产生潜在风险，如引发过敏反应、产生毒素等。
医药安全问题
基因治疗等医疗手段的应用，可能存在潜在的安全隐患，如基因编 辑的脱靶效应、基因治疗的副作用等。
基因工程载体
二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体
1、λ噬菌体载体的特征
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp， 两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称 为cos位点。λ 噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其 裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中 插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ 噬菌体 可作为基因载体的依据 。
第一节
微生物基因工程载体
克隆载体（cloning vecto载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子， 更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ 质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。
共同的特点：
①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵 母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
重组体的筛选
. .. . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
3、pUC系列质粒载体
（1）特点 具有更小的分子 量（2686bp）和 更高的拷贝数。 具有多克隆位点
可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因 （LacZ′），它编码β -半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸 ， 可以和β -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即α —互补 ，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是β -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β -半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到pUC质 粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。 可通过插入失活法进行筛选
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
基因工程载体名词解释
基因工程载体是指能将分离或合成的基因导入细胞DNA分子，并在其中得以维持的DNA分子。
这些载体通常具有特定的结构和功能，以便能够将基因导入细胞并保持其稳定性和表达。
基因工程载体的类型包括质粒DNA、病毒DNA和科斯质粒等。
其中，质粒是一种小型环状DNA分子，可以自我复制，并能够在细菌细胞中稳定存在。
病毒DNA则是一种感染细胞的病毒，其基因组可以插入外源基因并携带其进入细胞。
科斯质粒则是一种人工合成的质粒，具有特定的结构和功能，以便能够将基因导入细胞并维持其稳定性和表达。
在基因工程操作中，载体被用来将外源基因导入受体细胞，并在其中表达。
通过使用载体，研究人员可以更容易地操作和调控基因的表达，从而更好地了解基因的功能和作用机制，为疾病治疗、药物研发等提供重要的支持。
第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
基因工程：第四章-酵母基因工程
UBC4-UBC5双突变型：
UBC4-UBC5双突变型能大幅度削弱泛
素介导的蛋白降解。
7个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白 降解作用同样有效。
6、内源性蛋白酶缺陷型的突变宿主菌
酿酒酵母具有20多种蛋白酶 空泡蛋白酶基因PEP4野生型和
pep4-3突变株
B-半乳糖苷酶活性明显升高
（三） 酵母菌的载体系统
酵母基因工程
酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征 酵母菌的宿主系统 酵母菌的载体系统 酵母菌的转化系统 酵母菌的表达系统 利用重组酵母生产乙肝疫苗
1974 Clarck-Walker和Miklos发现在多数酿酒酵母 中存在质粒。
1978 Hinnen将来自一株酿酒酵母的leu2基因导入 另一株酿酒酵母，弥补了后者leu2的缺陷， 标志着酵母表达系统建立。
酵母菌有4个泛素编码基因：
UBI1 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI2 编码泛素-羧基延伸蛋白52 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI3 编码泛素-羧基延伸蛋白76 对数生长期表达 稳定期关闭
UBI4 编码泛素五聚体
对数生长期关闭 稳定期表达
酵母菌有7个泛素连接酶基因：
UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7
酵母菌表达外源基因的优势： 全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传 操作简便。 具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。 能将外源基因表达产物分泌至培养基中。 大规模发酵工艺简单、成本低廉。
不含特异性病毒、不产毒素，被美国FDA认定为 安全的基因工程受体系统。
酵母菌表达外源基因的缺点：
表达产物的糖基化位点和结构特点 与高等真核生物有差距。
特点：
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
2、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测； 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因 插入；
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
第4章 载体的选择与构建
大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。
pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主范围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元
基因工程-第四章
（4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
抗菌素抗性
外源DNA 无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体（Direct selection vectors）
直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化 菌细胞才能在选择培养基上生长。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。
各类载体
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
3. pUC系列
•University of California 的 J. Messing 和 J. Vieria 于1978年，在pBR322 的基础上改造而成，如 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、 pUC19。 • 元件来源
• 质粒空间构型与电泳速率
分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。
OC L
SC
质粒的生物学基本特性
1.自主复制性
• 质粒复制子是质粒 DNA 中能自主复制并维持正常拷贝数的 一段最小的核酸序列单位。
• 两部分组成：复制起始区（ori）及其相关的调控元件。 • 质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制。 • 质粒 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
必要的条件能力。
理想载体至少必备的条件
① 能在宿主细胞中自主复制 ②容易进入宿主细胞 ③ 容易插入外来核酸片段 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 ⑤ 具有合适的筛选标记 ⑥ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程是一种用于改变和改造生物体遗传基因的技术，它是利用分子生物学技术提高生物性状的一种新技术。
在基因工程中，需要使用一种材料将外源基因投入细胞中，这种材料就是载体。
基因工程中常用的载体有以下三种：
1. 质粒载体. 质粒载体是一种比较常见的基因工程载体，具有较强的稳定性，它是一种质粒DNA，也称为质粒DNA，不是单链DNA，它是由细菌质粒的DNA结合其它分子，形成质粒DNA的结构，具有可复制性能，可以在细菌或动物细胞中复制，具有较强的稳定性。
2. 杆状病毒载体. 杆状病毒载体是一种比较常见的基因工程载体，它由病毒的全基因组和其它分子形成，用来转移外源基因到细胞中，可以把外源基因转移到细胞核或任何其它的地方，可以实现基因工程的目的。
3. 化合物载体. 化合物载体是一种新型的载体，它是由多种不同的分子组成的，可以将外源基因转移到细胞核或其它位置，并且可以把这些基因在细胞中表达出来，从而实现基因工程的目的。
基因工程载体应该具备的条件及其原因
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第4章 基因工程载体
的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。一种
理想的质粒克隆载体应该具有两种选择标记基因，并且在选 择标记基因内有合适的克隆位点。常用的选择标记基因主要 是抗生素的抗性基因[如四环素抗性（Tetr或Tcr）、氨苄青霉 素抗性（Ampr或Apr）、卡那霉素抗性（Kanr或Kmr）、氯 霉素抗性（Cmlr或Cmr）、链霉素抗性（Strr或Smr）等]和β半乳糖甘酶基因。
（5）基因工程所应用的质粒通常为非传递性的松弛型质粒，
安全可控，不至于对操作者和环境带来不必要的危害。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
三、常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体 1977年，F. Bolivar和R. L. Rodriguez 构建了一个典型的用
于基因克隆的通用质粒载体—pBR322质粒载体。目前使用
白质分子，内部的核酸一般是双链线性DNA分子，也有的是
双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA以及单链 RNA等多种形式。不同种噬菌体之间，其核酸的分子量相差 可达上百倍。而且有些噬菌体的DNA碱基并不是标准的A、T、 C、G四种碱基组成。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
溶源性噬菌体的生命周期（引自吴乃虎，1998）
导致Ampr基因的失活。这种因DNA插入而导致基因失活的现
象，称之为插入失活效应。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
大肠杆菌pBR322质粒载体的结构图
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
pUC质粒载体
1987年，美国加利福尼亚大学（University of California）的 科学家J. Messing 和J. Viria在pBR322质粒框架基础上构建
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
噬菌体再感染。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
第四章克隆载体的特征及类型
一个强的选择标记。 4. 具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区
内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。 5. 能够导入寄主细胞，具备转化的功能。 6. 操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质
粒载体。
质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点 少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必 须对之进行改造构建： （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
质粒的构建
质粒
天然存在的两种质粒 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-
30/cell
pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell ，标记基因为Tcr
理想的质粒载体应具备的条件
1. 分子量较小。 2. 松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。 3. 具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
l - DNA
阻遏基因
重组基因
删除与整合基因
COS
3’
5’ TCCAGCGGCGGGG
头部合成基因
尾部合成基因
CCCGCCGCTGGA 5’
3’
COS
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
l 噬菌体生物学特性： 感染周期
E.coli
裂解
优点： 分子量小：4363bp, 容易纯化。 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而 且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，
内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。 5. 能够导入寄主细胞，具备转化的功能。 6. 操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质
粒载体。
质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点 少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必 须对之进行改造构建： （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
质粒的构建
质粒
天然存在的两种质粒 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制20-
30/cell
pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell ，标记基因为Tcr
理想的质粒载体应具备的条件
1. 分子量较小。 2. 松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。 3. 具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
l - DNA
阻遏基因
重组基因
删除与整合基因
COS
3’
5’ TCCAGCGGCGGGG
头部合成基因
尾部合成基因
CCCGCCGCTGGA 5’
3’
COS
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
l 噬菌体生物学特性： 感染周期
E.coli
裂解
优点： 分子量小：4363bp, 容易纯化。 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而 且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，
基因工程原理
上面都是识别6对碱基；还有识别8个碱基的如： NotI (GC↓GGCCGC). 由于切割位点不同，切割后产生的切口末端有： 平端：如EcoRV 粘端：如HindIII, KpnI等。粘端分为两种情况：5突出 和3突出。如HindIII 为3突出，KpnI为5突出。酶切后 产生的粘端退火后还可以互补。
3．II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 （1）识别序列和切割位点 绝大多数的II类限制性内切酶识别顺序长度为4，5， 6碱基对，但也有比较长的，如8，或十几个等。这些碱 基对的顺序呈回文结构，不同酶的识别序列和切割位点 是不同的。基因工程操作中常用的酶为识别6对碱基的 内切酶，如
BamHI（G↓GATCC） EcoRI（G↓AATTC） SacI （GAGCT↓C） XbaI （T↓CTAGA） KpnI （GGTAC↓C）, Hind III（A↓AGCTT） EcoRV（GAT↓ATC） XhoI （C↓TCGAG） SalI （G↓TCGAC）, ApaI （GGGCC↓C）
第四章 基因工程的一般原理
一、基因克隆所用的酶 酶是生物细胞产生的在体内外对生物化学物质起 催化作用的一类蛋白质。酶催化具有高效性、专一性 及其可调性。酶发挥作用需要最适的条件：温度、PH、 离子及其强度等。（酶的活性单位指在最适条件下在 1min 催化1 umol底物发生反应的酶量）。 生物体几 乎所有的反应是在酶的催化下进行的。 基因克隆所用的酶主要有：限制性核酸内切酶、 甲基化酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、反转录酶、磷 酸酶、RNA酶等。
（1）质粒的基本 pMB1 or ColE1 origin），因此它能独立宿主细胞的染色体DNA， 而自主复制。一种质粒载细胞的数目称为质粒的拷贝数。 不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，（复制需要的 多种酶由宿主细胞提供）根据质粒在宿主细胞所含拷贝数 得多少，将质粒分为两类：高拷贝的叫松弛型，一般在 10-60；低拷贝的叫严紧型，一般在1-3个。
第四章 基因克隆的质粒载体
2021/8/4
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2021/8/4
2021/8/4
2021/8/4
碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
2021/8/4
2021/8/4
8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法 (3)微量碱变性法
2021/8/4
氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
2021/8/4
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺
旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
2021/8/4
2021/8/4
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。 因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（ SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
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碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片段之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
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8.质粒ＤＮＡ的分离与纯化
(1)氯化铯密度梯度离心法 (2)碱变性法 (3)微量碱变性法
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氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子
量的细菌染色体易断裂成线性片段，而质 粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的 状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链 的碱基中，导致链的解旋；而且形成的 EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会 越低。
线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而 形成。称L构型。
2021/8/4
什么是超螺旋(superhelix 或supercoil) ？ DNA是以双螺旋的形式围绕着同一轴缠绕的，当双螺
旋DNA的这个轴再弯曲缠绕时，DNA就处于超螺旋状态， DNA超螺旋状态是结构张力的表现。超螺旋是DNA三级结构 的一个重要特征。
迁移作用(mobiligation): 由共存接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程.
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2021/8/4
从基因工程安全角度考虑，接合型质粒不宜作为克隆载体。 因为从理论上存在着发生使ＤＮＡ跨越生物种间遗传屏障 的潜在危险.
简述基因工程载体的特点
简述基因工程载体的特点基因工程载体是基因工程中的一种重要工具，它具有以下特点：1. 大小适中：基因工程载体通常是一段双链DNA分子，它的大小通常在几千到数万个碱基对之间。
这样的大小既能容纳所需的基因片段，又能在细胞内稳定复制和传递。
2. 载体复制能力强：基因工程载体需要具备在宿主细胞内稳定复制的能力，以确保基因片段的传递和表达。
为此，载体通常包含一个或多个复制起始序列（origin of replication，ori），使宿主细胞能够识别并启动载体的复制过程。
3. 多克隆位点：基因工程载体通常具有多个克隆位点，用于插入外源基因片段。
这些位点通常是具有特定限制酶切位点的DNA序列，使得外源基因片段能够被限制酶切开并插入到载体中。
4. 选择标记：为了能够筛选出已经转化了外源基因的细胞，基因工程载体通常还包含一个选择标记。
选择标记可以是一段与宿主细胞耐药性相关的基因序列，例如抗生素抗性基因，转化了该载体的细胞在含有相应抗生素的培养基中能够存活下来。
5. 表达调控元件：为了实现外源基因的表达，基因工程载体通常还包含一些表达调控元件。
这些元件包括启动子、转录终止子和调控序列等，它们能够控制外源基因的转录和翻译过程，使其能够在宿主细胞中产生所需的蛋白质。
基因工程载体的特点使其成为了基因工程研究和应用中的重要工具。
其大小适中，能够容纳所需的基因片段，并能够在细胞内稳定复制和传递。
通过克隆位点的设计，可以将外源基因片段插入载体中，并通过选择标记筛选出转化了外源基因的细胞。
而表达调控元件的存在，则使外源基因能够在宿主细胞中得到表达，并产生所需的蛋白质。
基因工程载体的应用非常广泛。
例如，基因工程载体可以用于基因克隆，将外源基因片段插入载体中，并通过转化技术将其导入宿主细胞，从而实现基因的研究和功能分析。
此外，基因工程载体还可用于基因表达，通过插入外源基因并调控其表达，使宿主细胞产生所需的蛋白质，例如生产重组蛋白和抗体等。
Ch04基因工程的常用载体-噬菌体和病毒载体
4. M13载体的构建 （1）选定克隆区域 1）M13基因间隔区（intergenic region, IG区） 514 nt (5501-6014)
4
M13 6.4 Kb
2）酶切位点 IG区内有两个 BsuI(HaeIII)（GG↓CC）位点 其余8个BsuI位点分布在其它部位
基因4
M13 IG区序列
第四章 基因工程载体
邢万金 内蒙古大学生命科学学院生物学系
第二节 噬菌体载体
一、单链噬菌体载体
单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd 等噬菌体 pIII(5) pVIII(2700) pVII
pVI(5) +DNA
M13丝状噬菌体
pIX(5)
1. M13单链噬菌体DNA的基因组织
（3）常用的 pBluescript 载体 pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-） SK：表示lacZ′ 的转录方向是沿MCS上的 SacI → KpnI KS：反向（ KpnI → SacI ，MCS相反） +（f1+）：单链复制起始方向背离 lacZ′， 能回收lacZ′ 的编码链（+） -（f1-）：能回收lacZ′ 的非编码链（-）
5. 对M13mp1载体的改进 M3mp2：在LacZα中引入单一酶切位点EcoRI M3mp1的LacZα的第6氨基酸有个EcoRI星号位点： ATGACCATGATTACGGATCCA TACTGGTACTAATGCCTAAGT O
O N N CH3 NH2
CH3 Eco RI* H2 N-Met Thr Met Ile Thr Asn Ser------N-甲基-N-亚硝基脲 l M13mp 2 ATGACCATGATTACGAATTCA 5 ′ ATGACCATGATTACGAATTCA5′ATGACCATGATTACGGATTCA----7250 bp GT TACTGGTACTAATGCTTAA 3 ′ TACTGGTACTAAhr Asp Ser------4
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又叫自我转移型质粒。 除了带有自我复制所必需的遗传信息外 还带有一套控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
如：F质粒（性质粒、或F因子）： 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道 转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
大肠杆菌接合（conjunction）
2. 非接合型质粒：
虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因， 因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。
（1）类型 天然质粒，属低拷贝型。
（2）长度 9.09 kb。 （3）选择标记 四环素抗性Tetr
（4）克隆位点 6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、 BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。
（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位 于选择标记Tetr的内部）
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。 B. 松弛型质粒（relaxed plasmid）
拷贝数多，有10—60份拷贝。 （非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。
三、质粒的不亲和性
不同质粒有的可共存于同一细胞之中，但有的不行。
把能同寓于一细胞中的不同质粒称为亲和性质粒。
相反不能同寓于一细胞中的不同质粒称为不亲和 性质粒或不相容性质粒。
符合基因工程的安全要求。
（1）R质粒（抗性质粒）：
带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获 得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
四环素
卡那霉素
链环素 磺胺 氨苄青霉素
汞盐抗性
（2）Col质粒： 带有控制大肠杆菌素（colicin）合 成的基因。
大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。
单链DNA噬菌体M13
来源
噬菌体的衍生物
柯斯质粒（cosmid）
动物病毒（virus）
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片段
功能 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达
整合载体: 把一个基因插入到染色体组中
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。
亲缘关系密切的质粒一般属于不亲和性质粒，如
野生型质粒与其衍生的重组质粒往往属于不亲和
性质粒。
（攘外必先安内）
四、质粒载体的构建
1. 天然质粒的局限性 （1）分子量大，拷贝数低
第一个用于基因克隆的天然质粒 pSC101，分子长 9.1 kb。
但只有一个EcoR I切点充当克隆位 点，Tetr 作为筛选标志。
过Dowex AG50W-X8柱子，用数倍体
积的TE/0.2mol/L NaCL清洗去除EB
proteins
ocDNA L-DNA cccDNA RNAs
二、质粒的类型
1、依据质粒自身传递的性质分类
在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒: 能自我转移 非接合型质粒 不能自我转移
1. 接合型质粒：
Col质粒或R质粒如果带有转移基因， 也可以成为接合型质粒。
2、依据可否引起宿主细胞出现新性状分类
显性质粒:宿主细胞由于含有质粒而获得新性状 隐蔽质粒:宿主细胞含有此类质粒而无异样性状
隐蔽是因为受检测的手段的限制，而不能观测到新性状
3、依据质粒的复制特性分类
A. 严紧型质粒（stringent plasmid） 拷贝数少，只有1—3份拷贝。
① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（SC）（super coil）
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
（5）质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构 型电泳迁移率不同： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
OC L
SC
（6）氯化铯密度梯度离心提取质粒
原 超螺旋质粒 开环和线性质粒 染色体DNA
理
加入EB
加入EB
结合EB少
结合EB多
紧密密度高
松散密度低
密度梯度离心分离
氯化铯密度梯度离心法步骤：
用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭 超速离心过夜 在紫外灯下注射器吸取cccDNA 稀释沉淀cccDNA
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
HindⅢ HpaI
EcoRI
EcoRI
Kil基因 Pkn80
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因置于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
2）大肠杆菌操纵子元件
阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。
抗性基因
死
抗菌素
活
5. 人工构建的质粒载体的类型
（1）高拷贝数的质粒载体
ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数 的特点。
而且在没有菌体蛋白质合成的条件下 （蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在 下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝 数1000—3000个！ 适合大量增殖克隆基因、或需要表达 大量的基因产物。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）
a）杀菌原理
通过与70S核糖体结合，导致mRNA发 生错读。杀死细菌。
b）细菌抗性原理
Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对 卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结 合作用。
iv）链霉素（Streptomycin，Str） a）杀菌原理
A、选用合适的出发质粒。出发质粒（也称为亲本质 粒）中应含有克隆载体必备的元件，如复制起始原点、 用于选择标记的基因、克隆位点 B、获得构建质粒克隆载体的元件。
C、组装合适的选择标记基因。
D、构建过程中，应尽可能的删除载体上不必要的 DNA序列，以缩小质粒的分子量，提高外源DNA的 装载量。 E、构建过程中，需要灭活出发质粒上的某些编码基因
利用质粒载体将真核生物基因转入大肠杆菌
中进行表达,该质粒载体应具备哪些元件?
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS 2）大肠杆菌操纵子元件 阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。
五、经典的大肠杆菌质粒载体 1. pSC101 第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质 粒载体。
b）细菌抗性原理
Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结 构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进 入细菌细胞内。
② 遗传标记 使受体菌发生遗传性状的改变的基因。
营养标记 其他标记：如蓝白斑筛选
（2）抗菌素选择原理
不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在 含有抗菌素的培养基（选择培养基）中 生长。
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌 后，受体菌才能生长。
1979年B. E. Uhlin等构建。 如pBEU1、pBEU2。
温度低（低于35 oC），拷贝数很少； 温度增加（>35 oC）时，拷贝数会很快增 加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
ColE1
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因
是筛选的标志。理想的载体应该有两 种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点： 用来插入外源DNA片段。且插入后不影 响复制功能。
（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 构建质粒克隆载体的基本原则
2. ColE1 （1）类型 天然质粒，属高拷贝型。 特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌 蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每 个细胞1000-3000拷贝之多！
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1 免疫的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
（2）低拷贝数的质粒载体
由pSC101派生来的载体特点是分子量小， 拷贝数低。
pLG338、pLG339、pHSG415等
不适合大量扩增DNA用。
但有特殊用途: 当有些被克隆的基因的表达产物过多时会 严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致 寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。
（3）失控的质粒载体
runaway plasmid vectors 这是一类温度敏感型复制控制质粒。
（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
a）抑菌原理 通过干扰细菌细胞壁合成的末端反 应，杀死生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml） a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀 死生长的细菌。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等胞中。
大肠杆菌的质粒
1. 质粒的一般生物学特性
（1）分子小：
1—500 kb
（2）编码基因少：
2—3个中等大小的蛋白质。
如：F质粒（性质粒、或F因子）： 甚至能使寄主染色体上的基因随其一道 转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
大肠杆菌接合（conjunction）
2. 非接合型质粒：
虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因， 因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。
（1）类型 天然质粒，属低拷贝型。
（2）长度 9.09 kb。 （3）选择标记 四环素抗性Tetr
（4）克隆位点 6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、 BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。
（其中Hind III、BamH I、Sal I 3个位 于选择标记Tetr的内部）
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。 B. 松弛型质粒（relaxed plasmid）
拷贝数多，有10—60份拷贝。 （非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。
三、质粒的不亲和性
不同质粒有的可共存于同一细胞之中，但有的不行。
把能同寓于一细胞中的不同质粒称为亲和性质粒。
相反不能同寓于一细胞中的不同质粒称为不亲和 性质粒或不相容性质粒。
符合基因工程的安全要求。
（1）R质粒（抗性质粒）：
带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获 得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
四环素
卡那霉素
链环素 磺胺 氨苄青霉素
汞盐抗性
（2）Col质粒： 带有控制大肠杆菌素（colicin）合 成的基因。
大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。
单链DNA噬菌体M13
来源
噬菌体的衍生物
柯斯质粒（cosmid）
动物病毒（virus）
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片段
功能 表达载体: 用于一个基因的蛋白表达
整合载体: 把一个基因插入到染色体组中
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。
亲缘关系密切的质粒一般属于不亲和性质粒，如
野生型质粒与其衍生的重组质粒往往属于不亲和
性质粒。
（攘外必先安内）
四、质粒载体的构建
1. 天然质粒的局限性 （1）分子量大，拷贝数低
第一个用于基因克隆的天然质粒 pSC101，分子长 9.1 kb。
但只有一个EcoR I切点充当克隆位 点，Tetr 作为筛选标志。
过Dowex AG50W-X8柱子，用数倍体
积的TE/0.2mol/L NaCL清洗去除EB
proteins
ocDNA L-DNA cccDNA RNAs
二、质粒的类型
1、依据质粒自身传递的性质分类
在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 接合型质粒: 能自我转移 非接合型质粒 不能自我转移
1. 接合型质粒：
Col质粒或R质粒如果带有转移基因， 也可以成为接合型质粒。
2、依据可否引起宿主细胞出现新性状分类
显性质粒:宿主细胞由于含有质粒而获得新性状 隐蔽质粒:宿主细胞含有此类质粒而无异样性状
隐蔽是因为受检测的手段的限制，而不能观测到新性状
3、依据质粒的复制特性分类
A. 严紧型质粒（stringent plasmid） 拷贝数少，只有1—3份拷贝。
① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（SC）（super coil）
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
（5）质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构 型电泳迁移率不同： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
OC L
SC
（6）氯化铯密度梯度离心提取质粒
原 超螺旋质粒 开环和线性质粒 染色体DNA
理
加入EB
加入EB
结合EB少
结合EB多
紧密密度高
松散密度低
密度梯度离心分离
氯化铯密度梯度离心法步骤：
用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭 超速离心过夜 在紫外灯下注射器吸取cccDNA 稀释沉淀cccDNA
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
HindⅢ HpaI
EcoRI
EcoRI
Kil基因 Pkn80
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因置于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
2）大肠杆菌操纵子元件
阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。
抗性基因
死
抗菌素
活
5. 人工构建的质粒载体的类型
（1）高拷贝数的质粒载体
ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数 的特点。
而且在没有菌体蛋白质合成的条件下 （蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在 下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝 数1000—3000个！ 适合大量增殖克隆基因、或需要表达 大量的基因产物。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）
a）杀菌原理
通过与70S核糖体结合，导致mRNA发 生错读。杀死细菌。
b）细菌抗性原理
Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对 卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结 合作用。
iv）链霉素（Streptomycin，Str） a）杀菌原理
A、选用合适的出发质粒。出发质粒（也称为亲本质 粒）中应含有克隆载体必备的元件，如复制起始原点、 用于选择标记的基因、克隆位点 B、获得构建质粒克隆载体的元件。
C、组装合适的选择标记基因。
D、构建过程中，应尽可能的删除载体上不必要的 DNA序列，以缩小质粒的分子量，提高外源DNA的 装载量。 E、构建过程中，需要灭活出发质粒上的某些编码基因
利用质粒载体将真核生物基因转入大肠杆菌
中进行表达,该质粒载体应具备哪些元件?
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS 2）大肠杆菌操纵子元件 阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。
五、经典的大肠杆菌质粒载体 1. pSC101 第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质 粒载体。
b）细菌抗性原理
Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结 构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进 入细菌细胞内。
② 遗传标记 使受体菌发生遗传性状的改变的基因。
营养标记 其他标记：如蓝白斑筛选
（2）抗菌素选择原理
不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在 含有抗菌素的培养基（选择培养基）中 生长。
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌 后，受体菌才能生长。
1979年B. E. Uhlin等构建。 如pBEU1、pBEU2。
温度低（低于35 oC），拷贝数很少； 温度增加（>35 oC）时，拷贝数会很快增 加到1000个以上。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
ColE1
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因
是筛选的标志。理想的载体应该有两 种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点： 用来插入外源DNA片段。且插入后不影 响复制功能。
（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
3. 构建质粒克隆载体的基本原则
2. ColE1 （1）类型 天然质粒，属高拷贝型。 特点是在培养基中加入氯霉素抑制细菌 蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每 个细胞1000-3000拷贝之多！
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1 免疫的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
（2）低拷贝数的质粒载体
由pSC101派生来的载体特点是分子量小， 拷贝数低。
pLG338、pLG339、pHSG415等
不适合大量扩增DNA用。
但有特殊用途: 当有些被克隆的基因的表达产物过多时会 严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致 寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。
（3）失控的质粒载体
runaway plasmid vectors 这是一类温度敏感型复制控制质粒。
（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
a）抑菌原理 通过干扰细菌细胞壁合成的末端反 应，杀死生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml） a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀 死生长的细菌。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等胞中。
大肠杆菌的质粒
1. 质粒的一般生物学特性
（1）分子小：
1—500 kb
（2）编码基因少：
2—3个中等大小的蛋白质。