菌种选育3.3

替考拉宁产生菌TA2-2组分高含量 菌种的推理选育
替考拉宁(teicoplanin)系替考游动放线 菌(Acti-noplanesteichomyceticus)发酵产生的 一糖肽类抗生素, 是5个化学结构十分相似化 合物(TA2-1,TA2-2,TA2-3,TA2-4,TA2-5)的混 合物。5个组分的差异仅在于酰基侧链的不 同。5个组分中TA2-2为主要有效成份。
微生物的突变类型多，可分为两大类， 第一类为形态突变株，包括菌落形态，菌丝 形态，分生孢子形态。另一类是生化突变株， 包括抗性突变型，营养缺陷型，条件致死突 变型，产量突变等。 因此，要在大量的细胞中寻找真正需要 的细胞，就象是大海捞针，工作量很大。简 洁而有效的筛选方法无疑是育种工作成功的 关键。
替考拉宁推理选育结果（3）：
表3 菌株98-1-227传代后的生产能力和TA2-2组分含量 传代 相对活力 TA2-2(%)
1 2 3 4
100 102 98 85
56.21 59.99 55.54 48.38
Avermectin产生菌诱导推理选育 avermectin(AVM)系一簇十六元大环内酯 类抗生素,它含有8个结构相似的组份:A1a、 A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b。8 个组分中B1a为主要有效成份。
替考拉宁推理选育方法：
1 诱变处理：
将替考游动放线菌的新鲜斜面孢子 制成单孢子悬浮液，吸取5ml于无菌双蝶 中，臵254nm，功率30W紫外灯下30cm 处，振荡照射100s。
替考拉宁推理选育方法：
菌株对缬氨酸氧肟酸敏感性的考察： 将未处理的单孢子悬浮液涂布于含不同 浓度的缬氨酸氧肟酸的平板培养基中，培养 后观察菌落的生长情况。 2
在提高筛选品质方面，由于过去对菌 体生理了解不够，只能随机筛选（random selection），大量筛选无特定标记的突变株， 因此筛选效率不佳；其后由菌株的生理研 究，以及由实际研发的经验，发展出合理 定向筛选（ rational selection ）技术。
菌种筛选方案
在实际工作中，为了提高筛选效率， 往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的是删去明确不符合要求的大部 分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留 下来，以多为，主使优良菌种不致于漏网。 复筛的目的是确认符合生产要求的菌株， 以质和精为主，应精确测定每个菌株的生 产指标。
耐高浓度酒精的酵母菌的酒精发酵 能力较高，也适宜提高发酵醪浓度，提 高醪液酒精浓度。 而耐高渗透压的酵母菌株具有积累 甘油的性能，可用于甘油发酵。 耐高酒精度、高渗透压的菌株也可 分别在高浓度酒精或加蔗糖等造成的高 渗环境下一次性筛选获得。
2）阶梯性筛选法
药物抗性即抗药性突变株可在培养基中 加入一定量的药物或对菌体生长有抑制作 用的代谢物结构类似物来筛选，大量细胞 中少数抗性菌在这种培养基平板上能长出 菌落。但是在相当多的情况下，无法知道 微生物究竟能耐受多少高浓度的药物，这 时，药物抗性突变株的筛选需要应用阶梯 性筛选法。
VH浓度(%)
++++:极好; +++:好; ++:中等; +:差;-:不生长
替考拉宁推理选育结果（2）：
表2 自然分离株、UV诱变株及VHr拮 抗株总产量及TA2-2含量比较 相对生产能力 TA2-2
平均 NS UV UV+VHr 100 102 127
最高 100 107 135
平均(%) 最高(%) 34 38 47 39.16 41.69 60.09
7 菌种筛选方法
所有的微生物育种工作都离不开菌种筛 选。尤其是在诱变育种工作中，筛选是最为 艰难的也是最为重要的步骤。经诱变处理后， 突变细胞只占存活细胞的百分之几，而能使 生产状况提高的细胞又只是突变细胞中的 0.05％～0 .2％。微生物的正突变概率极小， 产量提高10％以上突变株也只有1/300。
Comparison of the hypothetical reaction mechanism of SU10, SU11, and SU12 on avermectin PKS and milbemycin PKS
Avermectin用亮氨酸推理选育方法：
1 诱变处理将S.avermitilis XC1-25新鲜斜面培养物 制成单孢子悬浮液,吸取5ml放入无菌平板中,并 置于波长253.7nm、功率30W紫外灯下30cm处 开盖、振荡照射60s备用。 2 含有L-Ile平板的制备:将不含L-Ile培养基20ml 倒入培养皿内,平放,待凝后再倒入5ml含有 0.1%L-Ile的培养基,平放。 3 L-Ile变株的分离:将经UV处理过的存活孢子,以 适当浓度涂布于含有0.1% L-Ile的平板培养基上 培养,Ile变株系从这种培养基上生长的菌落中分 离得到。
8 抗性筛选
抗性突变株的筛选相对比较容易， 只要有10–6频率的突变体存在，就容易 筛选出来。 抗性突变株的筛选常用的有一次性筛 选法和阶梯性筛选法两种手段。
1）一次性筛选法 一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致 死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。
抗噬菌体菌株常用此方法筛选。将对噬菌 体敏感的出发菌株经变异处理后的菌悬液大量 接入含有噬菌体的培养液中，为了保证敏感菌 不能存活，可使噬菌体数大于菌体细胞数。此 时出发菌株全部死亡，只有变异产生的抗噬菌 体突变株能在这样的环境中不被裂解而继续生 长繁殖。通过平板分离即可得到纯的抗性变异 株。
3 缬氨酸氧肟酸抗性菌株的选育： 将诱变后的存活孢子涂布在含0.3%的缬 氨酸氧肟酸平板分离培养基中，筛选缬氨酸 氧肟酸抗性(VHr)突变株。
替考拉宁推理选育结果（1）：
表1
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
缬氨酸氧肟酸对产生菌生长的影响
生长情况* ++++ ++++ +++ ++ ++ ++ + -
Avermectin用亮氨酸推理选育结果：
Tab.1 Comparison of AVMB1 productivity among the natural isolates,UV mutants and the I-lei mutants B1 (%) average
NS UV UV+I-lei 100 109 114
Avermectin化学结构
Avermectin结构
每个组份的生 物合成途径如 下:AVM内酯 环由5个乙酸、 7个丙酸和1个 支链脂肪酸通 过1个聚酮体 的中间体合成。
Figure Biosynthesis of the avermectin
Comparison of the hypothetical reaction mechanism of SU1 and SU2 on avermectin PKS and milbemycin PKS
spnB
spnC spnD spnE spnF spnG spnH spnI spnJ spnK spnL
2153
3171 4929 5589 276 391 251 396 540 396 284
PKS
PKS PKS PKS 聚酮交链桥形成 鼠李糖转移酶 鼠李糖：O-甲基转移酶 鼠李糖：O-甲基转移酶 聚酮交链桥形成 鼠李糖：O-甲基转移酶 聚酮交链桥形成
9 推理选育 (Rational Selection)
抗生素产生菌的推理选育是建立在抗 生素生物合成机制已知或较清楚的基础上 按需要定向选育的一种方法。近几年研究 较多，应用较广，成效显著。就一些抗生 素而言，经过多年的研究，其代谢机理已 较清楚。实践证明，推理选育在抗生素育 种上的应用其效果远比传统的随机筛选优 越得多，只需适量筛选，即可达到所期望 的目的。
The highest
100 118 122
Structure of the spinosad（多杀菌素）
spinosads的生物合成
多杀菌素生物合成基因簇中各基因的功能
基因 spnA 大小 （氨基酸） 2596 推定功能 PKS 基因 spnM 大小 （氨基酸） 321 推定功能 聚酮交链桥形成
图 吡哆醇与代谢拮抗物异烟肼的分子结构
梯度培养法培育若干代谢产物的生产菌
代谢产物 肌苷 肌苷 腺嘌呤 烟碱酸 色氨酸 甲硫氨酸 酪氨酸 亮氨酸 吡咯叠氮 生产菌 短小芽孢杆菌 棒杆菌 鼠伤寒沙门氏杆菌 衣藻 伤寒沙门氏杆菌 大肠杆菌 大肠杆菌 伤寒沙门氏杆菌 金色假单胞菌 代谢拮抗物 8-氮鸟嘌呤 6-巯鸟嘌呤 2,6-二氨基嘌呤 3-乙酰吡啶 6-甲基色氨酸 乙硫氨酸 对氟苯丙氨酸 三氯-DL-亮氨酸 6-氟色氨酸
耐高温菌株法筛选：将处理过的菌悬 液在一定高温下处理一段时间后再分离。 对此温度敏感的细胞被大量杀死，残存的 细胞则对高温有较好的耐受性。 耐高温菌株在工业发酵中的应用意义 在于它可以节约冷却水的用量，尤其是在 夏季，并能减少染菌的机会。耐高温菌株 所产生酶的热稳定性较高，适用于一些特 殊的工艺过程。
阶梯性筛选法也有一定的缺点， 它们只有在抑制区域才能挑选抗性菌， 而低浓度区域面积较大，优良的抗性 突变株若被分散在低浓度区域或远离 纸片的区域，则可能没有被检出，因 此，漏检的几率较大。
(2) 纸片扩散法
纸片扩散法与梯度平板法的原理类似， 用打孔器将较厚的滤纸打成小圆片，并使纸 片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥， 放入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的 培养皿中等距放臵三片为宜。经培养后观察 围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就 是抗性菌。
筛选方案：
第三轮、第四轮…(操作同上)
初筛和复筛工作可以连续进行多轮， 直到获得较好的菌株为止。采用这种筛选 方案，不仅能以较少的工作量获得良好的 效果，而且，还可使某些眼前产量虽不很 高，但有发展前途的优良菌株不致于落选。 筛选获得的优良菌株还将进一步做工 业生产试验，考察它们对工艺条件和原料 等的适应性及遗传稳定性。
Hale Waihona Puke Baidu
梯度平板法也常用于抗代谢拮抗物突变株的筛选， 以提高相应代谢产物的产量。 异烟肼是吡哆醇的代谢拮抗物，两者的分子结构 类似。根据微生物产生抗药性原理，异烟肼抗性突变 有可能是产生了分解异烟肼的酶类，也有可能通过合 成更高浓度的吡哆醇来克服异烟肼的竞争性抑制。实 验证明多数菌株是发生了后一性质的变异才获得抗性 的。这样，通过梯度培养法就可以达到定向培育生产 吡哆醇的高产菌株。
因为药物抗性常受多位点基因的控制， 所以药物的抗性变异也是逐步发展的，时间 上是渐进的，先是可以抗较低浓度的药物， 而对高浓度药物敏感，经“驯化”或诱变处 理后，可能成为抗较高浓度药物的突变株。
阶梯筛选法由梯度平板或纸片扩散在培 养皿的空间中造成药物的浓度梯度，可以筛 选到耐药浓度不等的抗性变异菌株，使暂时 耐药性不高，但有发展前途的菌株不致于被 遗漏。阶梯性筛选法较适合于药物抗性菌株 的筛选，特别是在暂时无法确定微生物可以 接受的药物浓度情况下。
替考拉宁化学结构
L-缬氨酸是TA2-2组分的酰基侧链的生物 合成前体。在L-缬氨酸代谢途径中，L-缬氨酸 是该分枝代谢途径的第一个酶－－－乙酰乙酸 合酶的反馈抑制剂。因此，如果能够解除反馈 抑制，就能增加L-缬氨酸的浓度，有利于TA22组分的生物合成。 缬氨酸氧肟酸(valinehydroxamate，VH)为 L-缬氨酸的结构类似物，如果能够诱变得到缬 氨酸氧肟酸的抗性突变株，就有可能选育出 TA2-2组分含量高的替考拉宁高产菌株。
(1)梯度平板法(Gradient plate) 先将10ml左右的一般 固体培养基倒入培养皿中，将皿底斜放，使培养基凝结 成斜面，然后将皿底放平，再倒入7-10ml含适当浓度的 药物的培养基，凝固后放臵过夜。由于药物的扩散，上 层培养基越薄的部位，其药物浓度越稀，造成一由稀到 浓的药物浓度渐增的梯度。再将菌液涂布在梯度平板上， 药物低浓度区域菌落密度大，大都为敏感菌，药物高浓 度区域菌落稀疏甚至不长，浓度越高的区域里长出的菌 抗性越强。在同一个平板上可以得到耐药浓度不等的抗 性变异菌株。如果菌体对药物有个耐受临界浓度，则会 形成的明显界线。