大肠菌群和大肠杆菌检测方法
3、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌
↓36±1℃,48±2h
↓44.5±0.5℃,24±2h
————————
———————
↓
↓
↓
↓
浑浊，产气
不产气 浑浊，产气 不产气：粪大肠菌群阴性
查MPN表
大肠菌群阴性 查MPN表
报告大肠菌群
报告粪大肠菌群
的MPN值
的MPN值
大肠菌群计数检验的操作
MPN法
LST不产气（-） 小导管里无气泡
LST产气（+）
36℃±1 ℃ 培养24h
加入 Kovacs氏试剂
接触面红色，阳性
甲基红反应(MR)
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖 过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的 途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大 量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使 甲基红指示剂变红。
VRBA平板计数法
选择15~150平 板计数典型和
可疑菌落
36℃±1 ℃ 18h ~24h
典型菌落为紫红色 周围有红色胆盐沉
淀环，0.5mm
挑选10个菌落 接种到BGLB
结果报告
经最后证实大肠菌群阳性的BGLB试管比 例乘以VRBA菌落数再乘以稀释倍数，即为每 克（毫升）样品中大肠菌群数。 如：稀释倍数10-3 ,吸取样品稀释液1ml
大肠菌群和粪大肠菌群的检测流程图 MPN法
检样25g
↓
稀释（三个连续的稀释度，如10-1，10-2，10-3）
↓
接种（每个稀释度接种3管LST，每管1ml）
↓ 36±1℃,48±2h
——————————————
↓
↓
浑浊，产气
不产气
↓
报告大肠菌群阴性
水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测方法
水中总大肠菌群检测一般采用以下方法：
1. 高级培养基方法：将取样的水样加入适当的营养培养基中，培养出细菌，并计数大肠菌群的数量。
常用的培养基有大肠杆菌培养基、MacConkey培养基等。
2. 荧光定量PCR方法：通过PCR技术检测水中大肠菌群的DNA，使用荧光探针结构标记大肠杆菌特异性基因，通过测定荧光信号进行定量分析。
3. 流式细胞仪方法：将水样进行染色，然后通过流式细胞仪分析计数大肠菌群的数量。
常用的染色方法有DAPI染色法、荧光活菌染色法等。
4. 基于微生物生物传感器的方法：利用微生物细胞对特定细菌的识别和响应能力，设计合成生物传感器来监测水中大肠菌群的存在和数量。
以上方法可根据实际需要选择使用，各自具有不同的优缺点。
在进行水环境监测时，可以结合多种方法进行检测，以获得准确和可靠的结果。
食品微生物大肠菌群检测方法
食品微生物大肠菌群检测方法食品安全一直备受人们关注，而微生物大肠菌群是食品中常见的一种微生物污染物。
因此，建立一套有效的检测方法对于保障食品安全至关重要。
本文将介绍几种常用的食品微生物大肠菌群检测方法，希望能对相关领域的研究工作者提供一些参考。
首先，传统的培养法是一种常见的检测方法。
该方法通过将样品在特定的培养基上培养，利用大肠杆菌的生长特性进行检测。
然而，这种方法存在着检测周期长、操作繁琐、灵敏度低等缺点，无法满足现代食品安全监测的需求。
其次，分子生物学方法的应用逐渐成为食品微生物大肠菌群检测的主流。
PCR法是其中的一种常用技术，它利用特定的引物和酶对DNA进行扩增，通过检测扩增产物来判断样品中是否存在大肠菌群。
这种方法具有操作简便、灵敏度高、检测周期短等优点，已经成为食品微生物检测的重要手段之一。
另外，免疫学方法也是一种常用的检测技术。
ELISA法是其中的代表，它利用抗原与抗体的特异性结合来检测样品中的大肠菌群。
这种方法具有高度的特异性和灵敏度，适用于大批量样品的快速检测，被广泛应用于食品安全监测领域。
除了上述方法外，近年来基于生物传感技术的检测方法也逐渐受到关注。
生物传感器利用生物分子与传感器进行特异性识别，通过信号转导来实现对微生物的检测。
这种方法具有灵敏度高、检测速度快、操作简便等优点，对于食品微生物大肠菌群的检测具有重要的应用前景。
总的来说，食品微生物大肠菌群的检测方法多种多样，每种方法都有其独特的优势和局限性。
在实际应用中，需要根据具体的检测要求和条件选择合适的方法。
希望本文介绍的方法能够为食品安全领域的研究工作者提供一些参考，促进食品微生物大肠菌群检测技术的进一步发展和完善。
MPN大肠菌群大肠杆菌原理
MPN大肠菌群大肠杆菌原理MPN的全称是Most Probable Number，即最有可能数目。
MPN是一种用于测定微生物数量的方法。
在微生物学中，常常需要知道一个环境样品中微生物的数量，这对于病原微生物的检测、食品与饮用水质量的检验等具有重要意义。
MPN方法的原理基于一种统计学的原则，即当样品中存在微生物时，根据样本连续稀释后的阳性结果的比率可以估算样品中微生物的数量。
首先，将样品连续稀释，然后分别将稀释液接种到不同的培养基中，根据不同培养基的阳性结果来估算微生物数量。
大肠菌群是人类消化系统中的一类细菌。
它们主要分布在人体肠道的大肠中，经常与人体共生共存。
通常情况下，大肠细菌对人体有很多益处，如帮助消化食物、合成维生素等。
然而，有些大肠细菌可能是致病菌，会导致人体感染。
因此，对大肠菌群的检测对于维护人体健康具有重要意义。
大肠杆菌（Escherichia coli）是大肠菌群中的一种细菌，是最常见的肠道细菌之一、大肠杆菌是革兰氏阴性杆菌，通常呈杆状且单株分离。
它们在肠道中发挥着重要的生理功能，如参与食物消化、产生维生素和促进免疫系统的功能。
此外，大肠杆菌在医学和微生物学中也经常被用作实验模型。
大肠杆菌的检测原理一般采用培养方法。
首先，将样品中的细菌进行传代培养，为了区分大肠杆菌和其他微生物，通常会在培养基中加入选择性抑制剂。
在培养基中生长的细菌经过一段时间后会形成典型的大肠杆菌形态，如菌落大小、形状和颜色等。
此外，还可用生化试剂进行进一步检测，如糖发酵试验和气体产生试验等，以确定细菌是否为大肠杆菌。
总结起来，MPN是一种用于估算样品中微生物数量的方法，大肠菌群是人体肠道中的一类细菌，而大肠杆菌则是大肠菌群中的一种最常见细菌。
大肠杆菌的检测一般采用培养方法，通过培养基中细菌的生长和形态特征以及生化试剂的反应来确定是否为大肠杆菌。
这些检测方法对于保障人体健康和食品安全具有重要作用。
大肠杆菌及大肠菌群计数方法
大肠杆菌及大肠菌群计数方法大肠杆菌和大肠菌群计数方法Enumeration of Escherichia coli and the coliform章节内容：传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌（除双壳类软体动物制品外）瓶装水检测方法贝类和贝类肉制品检测方法柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法参考文件大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich 发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。
大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。
虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。
某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。
1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。
由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。
再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。
与已知的非产气致病菌容易区别开来。
因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。
肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂。
于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。
1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。
虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。
于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。
首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。
大肠菌群检验方法及操作方法
大肠菌群检验方法及操作方法1、什么是大肠菌群：指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。
2、大肠菌群的组成：大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。
3、大肠菌群的测定意义◆粪便污染的指标菌：大肠菌群或粪大肠菌群◆以大肠菌群作为粪便指标菌原因：1)在粪便中数量最大；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。
◆大肠菌群的测定意义：1)判断食品中否受到粪便污染。
2)有利于控制肠道传染病的发生和流行。
3)有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。
4、大肠菌群的生物学特性1 形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。
2 发酵乳糖产酸产气3 培养特性：在EMB琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；4 在麦康凯琼脂上的典型菌落：呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。
5、大肠菌群检验方法及操作方法◆国家标准：◆三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)◆行业标准：◆两步法：推测试验→证实试验表1 大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征MPN法简介Most Probable Number Method最大可能数•对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
•MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。
6、粪大肠菌群的检验•粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产气和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
•于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌；在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h 内产生吲哚的耐热大肠菌群。
检验方法：7、检验注意事项1）从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
大肠菌群及大肠杆菌检测方法
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法Method for examination of coliform ，fecal coliform and escherichia coli in food for exportSN 0169 —92代替ZB X09 002 —861 主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料2.1吸管：1mL，具O.ImL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2 2 水浴箱：44.5 ±.5C。
2.3 培养箱：36±1C, 44.5 ±.5C。
2.4冰箱：0〜5 C和-15〜-20Co2.5 均质器。
2.6乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm o2.8 天平：感量0.1g o2.9显微镜。
2.10稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11 玻璃珠：直径约5mm o2.12菌落计数器。
3 培养基及试剂3.1月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤。
3.2煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。
3.3 EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂（EMB）o3.5营养琼脂斜面。
3.6色氨酸肉汤。
3.7 MR-VP 培养基。
3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）o3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11生理盐水。
3.12革兰氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基质试剂。
3.14甲基红指示剂。
3.15 Voges—pros kauer（V —P）试剂。
4 样品制备4.1以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15C保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4C冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2—5C 18h内解冻，或在45C以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL 放入装有225mL 稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠），以30cm 幅度、于7s 内振摇25次（或以机械振荡器振摇），制成1 : 10的样品匀液。
大肠菌群及大肠杆菌检测方法
大肠菌群及大肠杆菌检测方法简介大肠菌群是指人和动物肠道中存在的一群细菌的总称，其中大肠杆菌是大肠菌群中的一种重要成员。
大肠杆菌是一种革兰阴性杆菌，属于肠道的常见菌群，对人体有益，并且在环境和食品中也常见。
然而，大肠杆菌也有一些致病的菌株，如致泻性大肠杆菌，会导致食物中毒和胃肠道感染。
大肠菌群检测方法大肠菌群的检测方法主要分为培养法和分子生物学方法两大类。
培养法：传统的大肠菌群检测方法是基于培养菌株的数量来进行评估。
这种方法通过将样品培养在选择性培养基上，利用大肠杆菌产生的特殊代谢产物来进行鉴定。
这一方法简单易行，成本较低，但存在一些局限性，如培养时间长，只能检测活菌，对于非培养性细菌较为困难。
分子生物学方法：分子生物学方法包括PCR和实时荧光定量PCR等技术，不依赖细菌的生长特性，能够快速准确地检测大肠菌群。
PCR是通过扩增大肠菌群的16SrRNA基因，然后通过电泳等方法进行检测和定量。
实时荧光定量PCR是一种更快速、灵敏和准确的检测方法，利用荧光探针技术可以实时监测扩增反应的过程，并定量测定大肠菌群的数量。
这种方法具有高度特异性和灵敏性，可以检测非活菌和少量菌。
大肠杆菌的检测方法主要分为传统培养法和分子生物学方法两种。
传统培养法：大肠杆菌的传统培养方法是将样品在选择性培养基上进行培养，利用大肠杆菌产生的代谢产物进行鉴定，并通过菌落数进行定量。
这种方法操作简单，成本较低，但存在一些问题，如需要较长时间培养（通常需要24-48小时），偶尔出现培养落阳性假阳性结果。
此外，该方法只能检测到特定培养条件下的大肠杆菌，并不能检测到非培养性或者少量存在的大肠杆菌。
分子生物学方法：分子生物学方法是通过扩增大肠杆菌特异基因或基因片段来进行检测。
常见的方法有PCR和实时荧光定量PCR。
PCR方法通过扩增大肠杆菌特异基因（如uidA基因）来进行检测，并通过电泳等方法进行鉴定。
实时荧光定量PCR是一种更快速灵敏准确的方法，可以实时监测扩增反应的过程，并定量测定大肠杆菌的数量。
食品中大肠菌群的检验
食品中大肠菌群的检验简介大肠菌群是指含有大肠菌属（Escherichia coli）和奇异变形杆菌属（Coliform bacteria）的细菌群体。
它们存在于人和动物的肠道中，也可以存在于环境中，如土壤、水体和食品中。
食品中的大肠菌群是导致食品中毒的主要病原体之一。
因此，对食品中大肠菌群的检验非常重要，以确保食品的卫生和安全。
本文将介绍食品中大肠菌群的检验方法和操作流程。
方法和步骤1. 样品采集样品采集是食品中大肠菌群检验的第一步。
根据需要检验的食品种类，选择合适的采样方法。
常见的食品样品包括水果、蔬菜、肉类和乳制品等。
采集样品时，应使用干净无菌的容器，并避免污染。
确保样品的代表性，避免极端状况下的取样，如选择已烂的水果或有明显变质的食品。
2. 样品处理样品处理是为了提取样品中的菌群以进行后续的检测。
处理过程应在无菌条件下进行，以避免外部的污染。
常见的样品处理方法包括：•加入盐水：将样品加入含有氯化钠的缓冲液中，以便菌群的释放。
•搅拌和均质：使用搅拌器或者均质器将样品搅拌均匀，以确保菌群的均匀分布。
•过滤：通过滤膜将样品过滤，以分离固体物质和悬浮物。
3. 培养基选择选择适当的培养基是进行大肠菌群检验的关键。
常用的培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂（Plate Count Agar，PCA）、大肠杆菌选择琼脂（MacConkey Agar）、经典蓝琼脂（Eosin Methylene Blue Agar）等。
不同的培养基适用于不同目的的检验。
PCA适用于总菌群计数，MacConkey Agar适用于大肠菌群的选择性检测，Eosin Methylene Blue Agar适用于大肠杆菌的计数和鉴别。
4. 培养和孵育将样品处理后的培养基平板进行孵育。
孵育的时间和温度根据菌群的生长特性而定。
一般情况下，孵育时间为24小时，温度为37摄氏度。
培养过程中，需要注意避免交叉污染。
每个样品应使用独立的培养基平板进行孵育，且标记清楚以区分不同样品。
医疗器械微生物检测标准
医疗器械微生物检测标准一、细菌总数检测细菌总数是指医疗器械单位体积中存在的活菌数量，是评价医疗器械卫生状况的重要指标。
细菌总数检测方法主要包括以下步骤：1.样本采集：随机选取医疗器械样品，如手术器械、导管、植入物等。
2.样品处理：将样品进行适当处理，如清洗、消毒等，以去除表面污染的细菌。
3.细菌培养：将处理后的样品接种至细菌培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24-48小时。
4.菌落计数：对培养出的菌落进行计数，并计算出每单位体积中的细菌总数。
二、大肠菌群检测大肠菌群是指一群革兰氏阴性杆菌，主要包括大肠杆菌、肠球菌等。
大肠菌群检测方法主要包括以下步骤：1.样本采集：随机选取医疗器械样品，如手术器械、导管、植入物等。
2.样品处理：将样品进行适当处理，如清洗、消毒等，以去除表面污染的大肠菌群。
3.培养基制备：制备适合大肠菌群生长的培养基，如麦康凯培养基等。
4.接种培养：将处理后的样品接种至培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24-48小时。
5.菌落计数：对培养出的菌落进行计数，并计算出每单位体积中大肠菌群的数量。
三、绿脓杆菌检测绿脓杆菌是一种常见的假单胞菌，具有较强的耐药性。
绿脓杆菌检测方法主要包括以下步骤：1.样本采集：随机选取医疗器械样品，如手术器械、导管、植入物等。
2.样品处理：将样品进行适当处理，如清洗、消毒等，以去除表面污染的绿脓杆菌。
3.培养基制备：制备适合绿脓杆菌生长的培养基，如TSB培养基等。
4.接种培养：将处理后的样品接种至培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24-48小时。
5.菌落计数：对培养出的菌落进行计数，并计算出每单位体积中绿脓杆菌的数量。
四、金黄色葡萄球菌检测金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性球菌，可引起严重的感染。
金黄色葡萄球菌检测方法主要包括以下步骤：1.样本采集：随机选取医疗器械样品，如手术器械、导管、植入物等。
2.样品处理：将样品进行适当处理，如清洗、消毒等，以去除表面污染的金黄色葡萄球菌。
大肠杆菌群检验的实验原理
大肠杆菌群检验的实验原理大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，广泛存在于人类和动物的肠道中。
大肠杆菌群检验是一种用于研究肠道菌群组成和功能的实验方法。
本文将从实验原理、样本采集、实验步骤、结果解读和临床应用等方面进行详细介绍。
实验原理：大肠杆菌群检验主要通过对肠道中细菌的DNA进行测序和分析来研究菌群组成和功能。
尤其是通过对16S rRNA基因序列进行分析，可以确定细菌的分类学信息，从而了解菌群的组成。
在这个实验中，主要使用PCR扩增和高通量测序技术。
1. 样本采集：在进行大肠杆菌群检验之前，需要采集肠道样本。
常见的采集方法包括粪便、肠黏膜组织和大肠黏膜刷取等。
样本采集要注意无菌操作，避免外源性细菌的污染。
2. 实验步骤：（1）DNA提取：首先需要提取样本中的DNA，这可以通过商业DNA提取试剂盒来完成。
提取的DNA浓度和质量要满足后续PCR扩增和测序的要求。
（2）PCR扩增：通过设计引物，选择16S rRNA基因的特异性区域进行扩增。
PCR反应体系中加入模板DNA、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
PCR反应的温度和循环次数通过程序设定。
（3）PCR产物纯化：将PCR扩增产物纯化，去除引物和杂质。
可以使用DNA 凝胶电泳和商业纯化试剂盒来进行纯化操作。
（4）高通量测序：纯化后的PCR产物进行高通量测序，可以采用Illumina MiSeq 或Ion Torrent等测序平台。
测序后得到的数据包括原始测序片段和测序质量值。
3. 结果解读：经过测序平台生成的数据可以通过特定的分析流程进行处理和解读。
首先将原始测序片段进行质控和过滤，去除接头序列和低质量序列。
然后对质控后的测序片段进行聚类和分类，可以使用聚类算法（如CD-HIT和UPARSE）和数据库（如Greengenes和SILVA）来进行分类鉴定。
最后，通过比较分析菌群间的差异，在样本之间实施群落结构和功能的比较。
4. 临床应用：大肠杆菌群检验可以用于研究肠道菌群与人类健康和疾病之间的关系。
大肠菌群测定步骤
食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测步骤一、培养基制备1、生理盐水氯化钠 8.5g蒸馏水 1000.0ml将氯化钠溶于蒸馏水中，搅拌均匀后用量筒量取225ml分装到各个广口瓶中，1210C高压灭菌15min，备用。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤称取37克放入烧杯，将各成分溶解于1000ml蒸馏水中，放电炉子上加热并搅拌均匀，分装于装有倒立发酵管的试管中，每管10ml，装完盖帽，1210C高压灭菌15min，双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。
3、样品制备（在无菌室中进行）（1）固体或半固体样品无菌操作称取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分振摇、混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
（2）液体样品以无菌吸管吸取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
4、样品稀释用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀，制成1：100的样品匀液。
按照该操作程序，可制备1：1000，1：10000。
等10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。
根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
二、大肠菌群的测定（MPN法）1、选取适宜的三个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml。
360C+10C培养24h-48h后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录24h和48h内产气的LST肉汤管数。
对未产气的试管，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如果所有LST肉汤管均未产气，可按。
报告结果；如果LST管有产气，则按下面步骤作证实试验。
大肠菌群测定步骤
食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测步骤一、培养基制备1、生理盐水氯化钠 8.5g蒸馏水 1000.0ml将氯化钠溶于蒸馏水中，搅拌均匀后用量筒量取225ml分装到各个广口瓶中，1210C高压灭菌15min，备用。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤称取37克放入烧杯，将各成分溶解于1000ml蒸馏水中，放电炉子上加热并搅拌均匀，分装于装有倒立发酵管的试管中，每管10ml，装完盖帽，1210C高压灭菌15min，双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。
3、样品制备（在无菌室中进行）（1）固体或半固体样品无菌操作称取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分振摇、混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
（2）液体样品以无菌吸管吸取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
4、样品稀释用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀，制成1：100的样品匀液。
按照该操作程序，可制备1：1000，1：10000。
等10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。
根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
二、大肠菌群的测定（MPN法）1、选取适宜的三个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml。
360C+10C培养24h-48h后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录24h和48h内产气的LST肉汤管数。
对未产气的试管，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如果所有LST肉汤管均未产气，可按。
报告结果；如果LST管有产气，则按下面步骤作证实试验。
大肠菌群能力验证
大肠菌群能力验证一、实验前期准备：1、检测项目：大肠菌群、大肠杆菌2、检测依据标准：GB 4789.3-2016 33、确认实验方案：把所涉及的试剂进行排查，查询是否缺某种试剂；根据检验标准，整理实验流程图，便于记录实验结果。
4、配置所需培养基：无菌生理盐水、结晶紫中性红胆盐琼脂、煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)肉汤等。
二、实验操作：1、收到样品后，确认样品包装是否完好，并将其保存在2~8℃冰箱中。
2、实验步骤2.1、样品接种方法选择和人员比对的探讨。
根据对能力比对的样品的评估，尽量选择稀释度范围较大一些，样品稀释梯度到10-6，选择GB4789.3-2016中第二法《平板计数法》；人员比对为两人。
2.2、进行实验：将样品从冰箱中取出达到室温后开启使用，在无菌室或生物安全柜下先用5mL稀释液（选取的生理盐水）进行水化后吸入无菌瓶或袋中，再用剩余的35mL稀释液进行洗涤并转入无菌瓶或袋中，即为原液。
注：1、按照说明书，水化冻干粉收集共40mL混匀作为原液备用2、开取西林瓶时，注意安全，以及观察能力比对样品状态是否完好。
2.2.1、再取25mL到225mL稀释液中混匀，制成10倍梯度样品匀液，稀释液手动混匀，混匀时注意观察是否有气泡产生。
2.2.2、用1mL无菌吸管取10倍的样液到9ml生理盐水试管中，制成100倍的样液，以此类推。
再将几个稀释度的样液接种1ml到平皿内，注入46±1℃的VRBA琼脂并摇匀。
从样品的制备到接种全程应不超过15分钟，然后在36±1℃中培养18～24h。
2.2.3、在培养24h时后，观察平皿内菌落生长情况，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
3、大肠菌群证实试验：3.1、用接种环从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑的菌落，分别接种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36℃±1 ℃培养24～48小时,观察产气情况。
大肠杆菌检测方法
大肠菌群及检验一、大肠菌群介绍大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致,其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。
调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因.粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多.大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
粪便是人类肠道排泄物,其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外,同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性.大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。
目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准.两个标准方法在检测程序上略有不同.（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。
乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。
36±1℃培养48±2h，观察是否产气.分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法Method for examination of coliform，fecal coliform and escherichia coli in food for exportSN 0169—92代替ZB X09 002—861 主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料2.1 吸管：1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2 2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：36±1℃，44.5±0.5℃。
2.4 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均质器。
2.6乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm。
2.8天平：感量0.1g。
2.9 显微镜。
2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11 玻璃珠：直径约5mm。
2.12菌落计数器。
3 培养基及试剂3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(LST)肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3 EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7 MR-VP培养基。
3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11 生理盐水。
3.12 革兰氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基质试剂。
3.14 甲基红指示剂。
3.15 V oges—pros kauer(V—P)试剂。
4 样品制备4.1 以无菌操作取有代表性的样品。
如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。
若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。
检验前冷冻样品可于2—5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s 内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1：10的样品匀液。
4.2.2 固体和半固体食品以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r／min均质1～2min，制成1：10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4.………。
从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。
5 大肠菌群的测定5.1 大肠菌群MPN值的测定5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。
每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(LST)肉汤，每管接种1mL。
5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。
如所有LST 肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。
5.2 大肠菌群的证实试验5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表(见附录B(补充件))报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN 值。
6 粪大肠菌群测定6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。
水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。
应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3 记录EC肉汤管的产气情况。
产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4 结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。
7 大肠杆菌测定7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36±1℃培养24±2h。
7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。
用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃培养18～24h。
7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2 MR—VP培养基；在36±1℃培养48±2h。
以无菌操作移取培养物1mL至13mm×l00mm试管中，加5％ɑ—萘酚乙醇溶液0.6mL，40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。
将MR—VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。
如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4 LST肉汤：于30±1℃培养48±2h，观察试管中是否产气。
7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。
大肠杆菌为革兰氏阴性。
7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：靛基质MR VP 枸椽酸盐鉴定（型别）+ + - - 典型大肠杆菌- + - - 非典型大肠杆菌+ + - + 典型中间型- + - + 非典型中间型- - + + 典型产气肠杆菌+ - + + 非典型产气肠杆菌如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为++--或-+--，再根据LST 肉汤阳性管数查MPN表，报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。
8 大肠菌群固体培养基测定法8.1 样品制备同第4章。
8.2 计数8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1mL。
另取lmL稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。
8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。
8.2.3 待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。
8.2.4 翻转平板，置于36±l℃培养18～24h。
8.2.5 选用有30～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。
菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6 证实8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h和48h，观察产气情况。
8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。
对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告经最后证实为阳性(产气，革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液lmL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6／10×104／g(mL)＝6.0×105／g(mL)附录 A培养基和试剂(补充件)A1 月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤胰蛋白或胰酪胨(Trypticase)20g氯化钠 5.0g乳糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g磷酸二氢钾(KH2P04) 2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中。
分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH6.8±0.2。
A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200.0mL0.1％煌绿水溶液13.3mL蒸馏水将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，pH7.0～7.5)，用蒸馏水稀释到975mL，调pH7.4。
再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到20mm×l50mm试管(管内有倒立的小发酵管)中，每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
最终pH7.2±0.1。
A3 EC肉汤胰蛋白或胰酪20.0g3号胆盐或混合胆盐 1.5g乳糖 5.0g磷酸氢二钾(KH2P04) 4.0g磷酸二氢钾(KH2P04) 1.5g氯化钠 5.0g蒸馏水1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中，分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)，每管8mL。
121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0。
1。
A4 伊红美蓝琼脂(EMB)蛋白胨10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾(KH2P04) 2.0g琼脂15.0g伊红γ(水溶性) 0.4g或2％水溶液20mL美蓝0.065g或0.5％水溶液13mL蒸馏水1000.0mL在1 000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。
分装于三角烧瓶中。
每瓶100mL或200mL，高压灭菌15min。
最终pH7.1±0.2。
使用前将琼脂融化，于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL 的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液，摇匀，冷至45～50℃倾注平皿。
A5 营养琼脂斜面牛肉膏 3.0g蛋白胨 5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000.0mL将各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解。
分装合适的试管。
121℃高压灭菌15min。
最终pH7.3±0.1。
灭菌后摆成斜面备用。
A6 色氨酸肉汤胰胨或胰酪胨10.0g蒸馏水1000.0mL加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。