酶的分离纯化过程中要注意什么问题
设计一个SOD的制备工艺及酶的分离纯化中要注意的问题
酶工程（二）姓名：刘芳颖班级：生物工程092 学号：2009016315一、设计一个SOD的制备工艺。
酵母泥酵母菌复壮SOD提取啤酒酵母的预处理：啤酒废酵母菌和等量无菌冰水混匀进行80-100的目筛再进行离心分离，将无菌冰水注入到下层沉淀中，摇匀静置3-4小时，倾去上层悬浊液，进行冰水漂洗直到所得上层清液无色无味酵母呈纯白色为止，从而得到较纯的酵母菌菌体。
酵母的复壮培养：酵母培养基配方：葡萄糖8%，蛋白胨1%，酵母膏1%，蒸馏水1000ml 在121℃灭菌20min，按30％接种量接入经过洗涤后的酵母，恒温摇床培养28℃140r/min2h，扩大培养，得到含SOD的湿菌体；酵母SOD的提取：每1 g酵母湿细胞中加入9 mL异丙醇浸泡120mim抽滤除去溶剂，加入三倍体积的50mmol/l磷酸钾缓冲液（PH7.0），搅拌120min离心除去菌体制成SOD粗提液SOD纯化：SOD粗提液用2mol/lHCL调节PH至5.0，加入丙酮搅拌摇匀，离心（5000r/min）取上清液调PH至4.0，加入丙酮二次沉淀，离心（5000r/min）SOD纯化产品。
二、酶的分离纯化中要注意什么问题，为什么要进行酶活力及酶比活力的测定？在酶分离纯化过程中，一个非常重要的问题是保护酶的活性，不使酶在纯化的过程中失活，因此酶提取纯化应注意以下问题：1）pH值，选择酶最稳定的pH值，确定合适的缓冲容量的缓冲溶液；2）温度，一般来说0℃时酶比较稳定，一般在0～4℃时操作；但有例外，如丙酮酸羧化酶，在0℃时不稳定，而在260℃时稳定；3）防止氧化：多含—SH，可加入β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等进行保护；4）避免重金属污染：主要注意溶液的配制，亦可加入EDTA络合去除；5）蛋白酶的污染：加入蛋白酶抑制剂如PMSF（苯甲基磺酰氟）、DFP（二异丙基氟磷酸）或胰蛋白酶抑制剂；6）介质的极性和离子强度：要求疏水环境可使用蔗糖、甘油等降低溶液的极性；需要提高离子强度的极性介质，可加入KCl、NaCl来调节。
酶的分离纯化
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五、抗体酶
五、抗体酶 （abzyme） ） 抗体酶本质上是免疫球蛋白， 抗体酶本质上是免疫球蛋白，但在易变区被赋予了 免疫球蛋白 酶的属性，所以又称“催化性抗体” 酶的属性，所以又称“催化性抗体”（catalytic antibody）。 ）。 抗原： 抗原：
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二、调节酶
• 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 调节酶是对代谢调节起特殊作用的酶类。 • 调节酶分子中有活性区和调节区，其催化活力 调节酶分子中有活性区 调节区， 活性区和
可因与调节剂的结合而改变， 可因与调节剂的结合而改变，有调节代谢反应 的功能。 的功能。
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三、酶的纯度鉴定
酶产品质量评价中常使用比活力， 酶产品质量评价中常使用比活力， 比活力越高，纯度越高。 比活力越高，纯度越高。
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第七节 一些酶的名称及概念介绍
寡聚酶( ) 一 寡聚酶(oligoenzyme)
酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地 非催化部位 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 非共价键结合后引起酶分子构象的改变， 进而改变酶的活性状态， 进而改变酶的活性状态，这种现象称为别 构调节作用。 构调节作用。
别构激活作用 别构抑制作用
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三、同工酶
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酶蛋白分离纯化注意事项 -回复
酶蛋白分离纯化注意事项 -回复酶蛋白分离纯化是生物化学研究领域的基础实验之一，通过对酶蛋白进行精细的实验操作，可以获取到纯度更高，质量更好的蛋白质，这对于相关领域的研究和发展具有重要意义。
在酶蛋白分离纯化过程中，需要注意的事项很多，本文将从实验条件、实验前准备和实验步骤等多个方面，介绍酶蛋白分离纯化过程中需要注意的事项，以期能够让大家更好地完成实验操作，提高实验效果。
一、实验条件1、温度：分离纯化酶蛋白时需要严格控制温度，一般要求在常温下操作，避免出现温度过高或过低的现象。
在实验过程中，需要使用加冷水浴或加热水浴的方式控制温度，同时需要定期检测温度是否合适。
2、pH值：pH值是影响酶蛋白活性的重要因素，因此在分离纯化酶蛋白时需要控制好pH值，避免因pH值过低或过高而影响酶蛋白的性质。
一般要求在 pH 7-8 之间进行操作，可以通过添加缓冲液的方式来控制 pH 值，同时需根据实验需要选择不同 pH值的缓冲液。
3、盐浓度：盐浓度是影响酶蛋白分离的重要因素，通过添加适量的盐可以使蛋白质分离得更好。
但盐的浓度过高也会对酶蛋白的性质产生不良影响，因此需要在加盐时掌握好浓度，避免对酶蛋白造成损伤。
4、细菌或病毒的污染：在酶蛋白分离纯化过程中，需要注意细菌或病毒的污染问题，以避免影响实验结果。
在操作过程中需要严格遵守无菌操作规范，并进行必要的消毒和消毒验证。
二、实验前准备1、实验器材：分离纯化酶蛋白需要使用一些特殊的实验器材，例如高速离心机、低温冰箱、电泳仪等。
在操作前需要检查这些器材是否正常运转，避免使用故障的器材影响实验结果。
2、实验试剂：对于酶蛋白的分离纯化需要使用一些特殊的实验试剂，如缓冲液、离子交换树脂、亲和层析树脂等。
在操作前需要检查这些试剂的保质期和质量，避免使用过期、腐败的试剂，造成实验结果的误差。
3、实验计划：在进行酶蛋白的分离纯化实验前，需要仔细制定详细的实验计划，并评估实验步骤的可行性。
酶蛋白分离纯化注意事项 -回复
酶蛋白分离纯化注意事项 -回复酶蛋白分离纯化是一项关键的生物技术操作，它对于分离和纯化酶蛋白具有极高的准确性和可靠性。
在进行酶蛋白分离纯化的操作过程中，需要注意以下10点事项：1. 样品选择和处理：样品的选择和处理是酶蛋白分离纯化的首要步骤，需要根据不同的酶蛋白特性进行选择，如酶蛋白的pH值、温度、介质、胁迫条件等。
样品的处理需要极为严谨，例如对于初步提取的酶蛋白，需在保持酶活性的基础上消除或减轻其它成分的影响，如溶解、过滤、调节pH值等处理。
2. 选择合适的萃取方法：针对不同的酶蛋白，需要选择适合它的萃取方法，例如超声波萃取、蒸馏萃取、酸性/碱性萃取、盐析等常见的分离柱方法。
3. 选择合适的分离介质：分离介质也是影响纯化效果的关键因素。
需要根据实验需求和样品的性质选择合适的分离介质，如分子筛、离子交换柱、亲和柱等。
这些分离介质的特性不同，选择的顺序也会有所不同，大多数情况下是根据介质的选择判断离子交换柱、亲和柱或分子筛的顺序，以达到最佳的纯化效果。
4. 确定溶液的pH值：在纯化过程中，pH值是要非常注意的因素。
这是因为酶蛋白的最适pH值对于其活性至关重要。
在进行分离纯化前应先测定样品的初始pH值，然后进行相应的调整以适应所选用的各种分离介质。
5. 确定适宜的洗脱条件：洗脱条件通常是为了最大程度地去除样品中的杂质，如亲和柱的洗脱条件是压力梯度，而针对离子交换柱则是碱度梯度。
确保洗脱的尽量高效，但要保持最大程度地减少酶蛋白的流失。
6. 注重洗涤步骤：本步骤是为了去除不同分子量的杂质或盐离子。
需要充分注意溶液的pH值、浓度和荷电性的调节，同时保证所选用洗涤剂的浓度适宜，使洗涤剂与酶蛋白之间的互作最大程度地延伸到稳定的化学状态。
7. 控制加/回流时间：无论哪种分离介质，都要注意加和回流时间的控制。
多数情况下，进行加溶剂的过程是从浓度梯度低到浓度梯度高的过程，加液的速度应该足够缓慢，以免发生分流现象。
8. 控制加溶剂的速度：加溶剂时需要控制加液速度.速度过快或过缓都会导致分离纯化效果下降，过快的加溶剂速度可能会破坏酶蛋白的活性或者不充分地纯化酶蛋白，甚至在离子交换柱中会导致柱床破裂，设备损坏等一系列后果。
碱性磷酸酶分离纯化方案(优质版)
样品体积放大，离心困难
① 要让100 ml的样品中硫酸铵百分比从0%到25%， 如果是 加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100 ml变成107 ml左 右，但若是加入硫酸铵饱和溶液，会让溶液变成125 ml。 ② 若是要提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶液，所以 会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。
① 防止酶变性失活。一旦酶回收率明显下降，就要考虑换一种纯 化方法； ② 计算纯化效率。通过纯度倍数（酶比活力提高比），评估纯化 效率，寻找最佳方法。
纯化倍数与回收率两者不能兼顾，从表中可看出：
纯度提高1200倍； 酶活力从原来的5000u减至1500u，产率为30%。
1000ml的粗体液，总酶活5000u，经5次纯化，最终获得4ml的纯酶，酶比活从原来的0.416u/mg至500u/mg蛋白，
2.硫酸铵边搅拌边缓慢加入，避免溶液
中硫酸铵局部浓度过高；搅拌需温和， 避免产生大量气泡。
取上清液缓慢加人硫酸铵固体至0.35饱和度，静置于4℃冰箱中1h，而后 4℃8000r/min离心20min，除去沉淀的杂蛋白。
取上清液缓慢加人硫酸铵固体至0.7饱和度，静置于4℃冰箱中1h，而后4℃8000r离 心20min，弃上清液，保留沉淀。
谢谢
2.有可靠的测活方法 测活方法的高灵敏性、准确性在分离纯化的初始阶段尤为重要，如果测活方法 不可靠，就无法确定酶在哪一部分有没有存在。故提取、纯化的每一步都应进 行酶活力的检测。
3.酶原料的选择
选择目的酶丰富的原料，同时考虑原料的来源、取材方便、经济因素。
4.注意分离方法的使用顺序 （1）先用低分辨率的方法 离心、沉淀、过滤等 （2）后用高分辨率方法 离子层析、膜分离、结晶 （3）昂贵、分离规模小的放最后 凝胶层析、亲和层析、HPLC等
酶的分离纯化(上)
sephacyl S-系列，是适合N,N’-甲叉双丙稀酰胺 交联成的烯丙基葡聚糖，可用于水溶性系统，也适 用于有机溶剂或高浓度氢链解离试剂存在的系统。
② 聚丙烯酰胺凝胶
如：Bio-Gel P-系列，是聚丙烯酰胺与交联剂 N,N’-甲叉双丙稀酰胺共聚得到的交联凝胶。 P-后的数字乘以1000，表示凝胶用于分离 的最高分子量。
二、酶源选材：
1、目的酶含量要丰富 2、取材要方便 3、成本经济低廉 三、建立适当的纯化方法和活力检测方法
即要考虑：高灵敏性、准确性、所用仪器试 剂，又要注意纯化方法经济实效，多种方法 配合使用。
Section 2 酶的提取
提取的目的：将尽量多的酶和尽量少的杂质 从原料引入溶液。
一、预处理和细胞破碎： 材料要新鲜或冰冻 1、动物材料要去结缔组织和脂肪组织。 2、植物种子要先脱脂。 3、微生物则应将菌体和发酵液分离。
分辨率Rs=两峰带间距离/峰带宽，当Rs=1.2时， 基本达到要求。
*分辨率Rs与层析柱的大小及柱长有关，一般的 是Rs∝L½ ， L为柱长。但柱太长时，流速又 应为f=p·r²/L,p为压强，r为柱半径。
柱太小时，可能产生壁效应，发生拖尾现象
柱太大时，可能产生稀释效应以及峰形不均匀
所以柱长与内径应有适当的比例，常用的为 1/20~1/40
细胞破碎
1、机械破碎：
高速组织捣碎 （中等） 植物种子
手工匀浆、研磨（温和） 动物组织
球磨
（剧烈） 微生物
2、理化方法：
超声波破碎 125w 5min 细菌
化学溶胀
红血球
酶解
细菌
微生物脂肪酶的纯化方法概述
微生物脂肪酶的纯化方法概述摘要：脂肪酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于食品、精细化工、医药和能源等领域。
脂肪酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。
本文综述了脂肪酶性质及应用，微生物脂肪酶的常规纯化方法和新型纯化方法，并展望了脂肪酶分离纯化的研究方向及前景。
关键词：微生物脂肪酶；纯化；常规分离纯化技术；新型分离纯化技术1.脂肪酶概述脂肪酶是一类特殊的酞基水解酶，其天然底物是油脂，主要水解由甘油和12碳原子以上的不溶性长链脂肪酸形成的甘油三酯，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。
同时还催化其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、氨解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成反应。
1.1脂肪酶的结构与性质在现代生物工程技术的参与下，人们对脂肪酶的结构研究也不断深入。
研究表明，脂肪酶是一种“丝氨水解酶”。
其活性中心都存在His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gl或Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W、X、Y、Z指非特异性氨基酸)相同或相似的一级结构氨基酸序列，在此基础上，His、Ser与另一种氨基酸残基(如CCL和GCL的Glu、RML和hPL的Asp等)一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组；从结构功能的角度，脂肪酶中的丝氨酸-OH基既具有底物结合作用，又具有催化作用。
与大多数酶一样，脂肪酶的本质仍然是蛋白质，其氨基酸组成数目从270-641kd 不等，分子量处于25一100kd之间，等电点(Pl)在4-5之间不等。
脂肪酶的催化性质主要表现在催化甘油三酯的水解、催化酯交换和催化拆分手性化合物三个方面。
在催化油脂水解的反应中，脂肪酶表现出一定的脂肪酸特异性，其主要催化带12个碳原子以上的长链脂肪酸的甘油三酷，该反应可逆。
此外，来源不同的脂肪酶在催化油脂水解时还具有明显的轻基位置特异性。
1.2产脂肪酶微生物微生物脂肪酶的发现是在20世纪初，而国内直到60年代才开始了这方面的研究与开发，其中具有代表性的报道是，1967年中科院微生物所筛选得到解脂假丝酵母菌株，并于1969年制成酶制剂供应市场。
酶的分离纯化
三浓缩 1蒸发 2超过滤 3胶过滤 4反复冻融
三酶的纯化原理与方法
1根据溶解度的不同进行的纯化 A盐析法 B有机溶剂沉淀法 C共沉淀法 D选择性沉淀法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2按照分子大小进行的纯化
A胶过滤（层析）法 B 超过滤法 C超离心法
三根据电学解离性质进行纯化
酶的分离纯化与制剂
一酶分离纯化工作的基本原则 酶分离纯化工作包括三个基本环节： 1抽提（extraction） 2纯化（purification） 3制剂（preparation）。
抽提是要将酶从原料中抽提出来作 成酶溶液；
纯化则是要将酶和杂质分离开来，或者选 择地将酶从包含杂质的溶液中分离出 来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出 去； 制剂则是要将纯化的酶作成一定形式的制 剂。
为了能够成功地进行酶的分离纯化， 应注意以下问题。
1防止酶变性失效 2选择有效的纯化方法 3酶活性的测定贯穿纯化过程的始终
二酶的抽提
一预处理和破细胞 二抽提 1pH 首先应考虑的是酶的酸碱稳定性，选 择的pH不能超过酶的稳定范围。 2盐 抽提液一般采用等渗盐溶液，最普通的 有0.020~0.050mol/L的磷酸缓冲液， 0.15mol/LNaCl溶液等。 3温度 抽提温度一般控制在0~4℃.
A吸附层析法 B离子交换层析法 C电泳法 D聚焦层析法 E快速液相层析法 F疏水层析法
四利用专一亲和作用进行纯化
1亲和层析法 2亲和电泳法 3融合蛋白亲和分离法 4其他相关的亲和分离法 A金属螯合层析法 B共价层析法
《酶工程》考试问答题总结(含答案)
《酶工程》考试问答题总结（含答案）1、利用微生物生产酶制剂的优点是什么？对产酶菌种的要求是什么？答：优点：1）微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变、可变。
2）微生物繁殖速度快，生产周期短，生产能力强，产酶量高。
3）易分离提取，特别是胞外酶。
4）原料来源广泛，价格便宜，生产成本低。
5）容易实现大规模机械化，自动化连续化工生产。
6）可利用生物工程新技术，选育新菌种，提高产酶量，增加酶种。
要求：1）不是致病菌，在系统发育上，最好与病原体无关。
在食品与医药方面注意安全性。
2）能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量子。
3）菌种遗传性要稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体，保证生产的稳定重要性。
4）最好选用产胞外酶的菌种，有利于酶的分离，回收率高。
2、酶分子修饰的原因、目的和基本原理是什么？主要的修饰方法是什么？答：原因：（1）活力问题：酶目前来源是生物材料，生物技术和产量有限，活力不高。
(2)稳定性问题：酶是蛋白质，一般不稳定，使酶制剂的生产，保存反应有很大不便和问题（3）具有抗原性：酶是高分子蛋白质，作为药物使用，在生物体中有抗原反应及被抗体代谢失效的危险。
（4）反应控制问题：实际反应中pH、温度等多种因素不易达到保持酶的最适合条件。
目的：提高酶活力；增强酶的稳定性；降低或是消除酶的抗原性，总之可以大大改善天然酶的不足之处，使其更适合于工业生产的应用要求。
3、酶活力测定需注意哪些问题？答：（1）测定的酶反应速度必须是初速度：一般指底物消耗量在5%以内或是食物形成占总产量的15%一下时的速度，只有初速度才与底物浓度成正比;(2)反应必定在酶最适合的反应条件下进行；（3）用反应速度对酶速度作图应将是一条通过原点的直线；（4）底物浓度，辅助因子浓度必定大于酶浓度；（5）测酶活力所用试剂中不应含有酶的抑制剂，激活剂。
4、简述酶提取的方法与过程。
答:1）方法：a 盐溶解提取 b 酸溶液提取 c 碱溶液提取 d 有机溶液提取。
酶的分离纯化
第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。
一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。
常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。
物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。
即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。
酶提取的主要方法和注意事项
酶提取的主要方法和注意事项
酶提取的主要方法：
1. 食物酶提取：将食物酶从植物或动物中提取出来，常用的方法有超声波处理、磨碎、离心、过滤和吸附等。
2. 微生物酶提取：将微生物酶从土壤中提取出来，常用的方法有振荡培养、深桶培养、喷雾培养等。
3. 动物酶提取：将动物酶从动物组织中提取出来，常用的方法有超声波处理、磨碎、离心、过滤和吸附等。
酶提取的注意事项：
1. 样品准备：在提取酶之前，应准备好样品，并将它们放在干燥处储存。
2. 酶稳定性：应确保酶的稳定性，以避免提取过程中的损失。
3. 防止污染：在提取酶的过程中，应防止其它酶的污染。
4. 避免高温：在提取酶的过程中，应避免高温，以避免酶的失活。
5. 储存酶：提取出来的酶应放在干燥处储存，并尽量避免接触空气，以避免酶的失活。
6. 确定活性：在提取酶之前，应先确定酶的活性，以便选择合适的提取方法。
酶的分离纯化中应该注意的问题
酶的分离纯化过程重要注意的问题？在酶的分离纯化过程中为什么进行酶活力，酶比活力的测定？生物技术091 支慧俊 08014177酶的分离纯化酶的分离纯化最主要是保持酶的活性，只要有可能引起酶变性失活的因素都应注意，温度，酸碱度，重金属等。
生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着每一步骤的取舍。
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酶分离纯化过程中的问题以及进行酶活力等测定的意义班级:生物技术133 组别：第六组姓名：董冰夏学号：2013013906
酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
因为酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
酶是一种特殊的蛋白质，在分离纯化过程中需要注意温度以及PH值等的控制，注意在纯化过程中所使用的缓冲溶液的离子强度的控制(常用PBS缓冲溶液)，在实际纯化过程中，一般要在低温冰箱中进行，缓冲溶液中注意加入EDTA二钠盐(1-5mM)螯和重金属离子一般避免酶失活。
常用分离步骤包括分子筛层析、离子交换、疏水层析等步骤。
同时要注意防止酶的变性失活。
酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。
此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时．酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用。
酶具有催化活性。
检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方法和条件提供直接依据。
在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性．一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。
酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
酶比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。
酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。
利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度
高低的一个重要指标。
酶活回收率等于每次的总活性除以第一次的总活性.其实就是一种衡量酶纯化的指标。
在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。
主要为了防止酶变性失活。
一旦活力明显下降，就要考虑换一种纯化方法。
同时计算纯化效率，通过总活力和比活，评估纯化效率，寻找最佳方法。