蛋白质组学常见问题解答(参考资料)

1、iTRAQ和label-free所用的搜库软件及其版本、定量分析软件是否一致？

答：搜库软件是不一致的：iTRAQ数据采用Mascot（2.3.0）；label-free则是maxquant（1.4.1.2）。

2、iTRAQ/TMT和Label-free技术都有哪些优缺点？

答：（1）定量准确性：iTRAQ/TMT的定量准确性和重现性要明显优于Label-free，Label-free的样本之间不能直接混合，导致定量的结果受到的影响因素多，因此定量结果的准确度较低；

（2）鉴定通量：Label-free通量相对较高，而iTRAQ/TMT由于标记基团的影响，鉴定通量较label-free 低；

（3）修饰组学：label-free定量，修饰肽段的富集（即IP）是各组分开进行的，很可能造成富集的不平行，最终造成定量不准确。因此，我们通过加入内标肽段来归一化以减少富集步骤引入的误差。而iTRAQ/TMT标记的修饰组，修饰肽段的富集是各组标记、混合后同时进行的，所以不会存在富集的不平行。因此，修饰组的定量，iTRAQ/TMT方法的定量准确性优于label-free；

（4）其它：目前泛素化修饰定量组学只能用label-free来做。。

3、常用的蛋白质翻译后修饰参考数据库有哪些？

4、HPLC分级的标准及作用是什么？是否组分越多通量越高？

答：HPLC分级有两个目的：1.降低每个组分中蛋白的复杂度，利于质谱鉴定；2.增加每个组分中每个蛋白的含量，同样利于质谱的鉴定。组分的多少和样品的复杂程度有关，如果分级数太少，没有达到降低样品复杂度的作用，如果分级数目太多，反而会降低每个组分中每个蛋白的含量，并且组分越多蛋白损失越大，因此分级太少和太多都不利于质谱鉴定，我们公司的分级数目是经过系统考察得到的最优选择。

5、公司目前使用的蛋白浓度测定方法是什么？

答：我们的蛋白浓度测定使用GE公司的2D Quant kit完成，该试剂盒可耐受8 M urea和2% SDS，明显优于其它浓度测定方法。并且我们在浓度测定后会取20μg蛋白通过SDS-PAGE来确定蛋白提取是否良好，浓度测定是否准确。

6、公司采用何种蛋白酶进行蛋白酶解？

答：公司通常采用胰蛋白酶，并结合两步酶解法，酶解更充分。特殊样品我们会采取针对性的蛋白酶进行酶解。

7、什么类型样品需要去除高丰度蛋白？我们采取什么策略去除高丰度蛋白？

答：需要去除高丰度蛋白的常见样品包括血清、血浆和脑脊液等富含白蛋白和免疫球蛋白的样品，我们一般采用的去除高丰度蛋白试剂盒为：proteominer TM protein enrichment small-capacity kit (Bio-Rad)。

8、为什么目前不能用iTRAQ和TMT技术做泛素化修饰定量相关项目？

答：（1）泛素化一般发生在赖氨酸上，蛋白质的泛素化修饰就是蛋白质的赖氨酸残基位点与泛素分子的羧基末端相互结合的过程。泛素分子的C末端为R-G-G结构，与赖氨酸发生了泛素化修饰后其侧链的氨基就会带上-G-G-R-的结构。当加入trypsin酶解时，该侧链就会被切开，变成-G-G-NH2（赖氨酸上的）；

（2）而目前我们公司自主研发的泛素化抗体（PTM-1101)，即赖氨酸双甘氨酸（glycine-glycine)抗体，只能识别含GG的肽段；这也是PTM-1101能识别发生泛素化修饰的肽段而不能直接识别蛋白的原因；

（3）iTRAQ和TMT试剂均能标记肽段的N端以及侧链氨基的末端，那么也因此可以标记在-G-G-NH2上，iTRAQ和TMT试剂都是大分子，分子量分别有三百多和二百多，远大于小小的-G-G-，因此这时IP 时赖氨酸双甘氨酸（glycine-glycine)抗体就很难富集到该肽段，这就是该目前的瓶颈；

（4）值得期盼的是，目前技术部正在探索一种克服该瓶颈的方法。另外，利用label-free技术来做修饰定量的尝试在正在进行。相信不久泛素化修饰的标记定量和非标定量项目都可以做。

9、修饰定量组学需要做重复分析实验么？

答：严格的来说，任何实验为确保结果的准确性都需要生物学重复。从实验的准确性和文章发表的要求来说，对于组织类样品（包括动物、植物），我们建议客户开展至少三个生物学重复。此外，对于组织类样品，如果单一组织样品提取蛋白量不够或样本数量较多，可考虑同一属性样本的混合后分析。根据研究的需要，还要考虑对每一组织个体样品进行三次质谱分析的技术性重复。对于细胞类样品（包括微生物样品），我们建议客户开展至少三次质谱分析的技术性生重复。