【CN110075050A】一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清中细胞因子冻干粉的制备方法【专利

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910194327.X (22)申请日 2019.03.14

(71)申请人 江苏全能干细胞生物工程有限公司

地址 210032 江苏省南京市浦口区星火路

10号鼎业百泰大厦B座202-1室(72)发明人 徐念沁　殷勤伟　徐全成　陈文均　

胡佳丽　(74)专利代理机构 北京华际知识产权代理有限

公司 11676

代理人 张伟(51)Int.Cl.

A61K 8/98(2006.01)A61K 8/64(2006.01)A61K 8/60(2006.01)A61K 8/34(2006.01)

A61K 8/73(2006.01)A61K 8/02(2006.01)A61Q 19/08(2006.01)A61K 35/28(2015.01)A61K 38/19(2006.01)A61K 9/19(2006.01)A61K 47/26(2006.01)A61P 17/00(2006.01)A61K 31/728(2006.01)

(54)发明名称

一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清中细胞因子冻干粉的制备方法(57)摘要

本发明公开一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清细胞因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：制备原代脂肪间充质干细胞及原代脐带间充质干细胞，建立细胞库；复苏P1代脂肪间充质干细胞、P1代脐带间充质干细胞，加入生理盐水，离心，收集细胞沉淀，接种于无血清培养液中，进行铺板培养；铺板培养4-5天后细胞密度达到70％，收集培养上清，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，培养至P5代，收集培养上清；向含P5代细胞的细胞工厂中加入生理盐水，反复冻融后与收集的P2至P5间充质干细胞培养上清混合，离心去沉淀；添加海藻糖、甘露醇和透明质酸，进行超低温抽真空冻干，

得到细胞因子冻干粉。

权利要求书1页 说明书5页 附图6页

CN 110075050 A 2019.08.02

C N 110075050

A

权　利　要　求　书1/1页CN 110075050 A

1.一种用于消除妊娠纹的间充质干细胞培养上清细胞因子冻干粉的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

a)三甲医院妇产科获得脐带组织，生理盐水清洗，取华通氏胶，接种于无血清培养液中，培养第15天，细胞密度达到50％，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后离心收集细胞沉淀，加入冻存液-80℃冻存细胞；

b)三甲医院整形外科获得脂肪组织，生理盐水清洗，脂肪组织和Ⅰ型胶原酶按比例1:1混合，震荡水浴酶消化获得原代脂肪间充质干细胞，接种于无血清培养液中，培养第7天，细胞密度达到50％，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后离心收集细胞沉淀，加入冻存液-80℃冻存细胞；

c)复苏P1代脂肪间充质干细胞、P1代脐带间充质干细胞，加入生理盐水中，离心，收集细胞沉淀，接种于无血清培养液中，进行铺板培养；

d)铺板培养4-5天后细胞密度达到70％，收集培养上清，加入EDTA重组胰蛋白酶消化细胞，生理盐水清洗后重新铺板，按照此方法培养至P5代，收集培养上清；

e)混合P2至P5代间充质干细胞培养上清，进行细胞裂解后，去除细胞碎片沉淀；

f)往步骤e)中去除细胞碎片沉淀的培养上清中，添加海藻糖、甘露醇和透明质酸；

g)将步骤f)中添加海藻糖、甘露醇和透明质酸的的培养上清混合液，进行超低温抽真空冻干，得到细胞因子冻干粉。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中P1代脂肪间充质干细胞、P1代脐带间充质干细胞的数量比为1:1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中的铺板方法为，按照接种密度为4000-5000/cm2进行铺板，细胞工厂中培养液体积/培养面积为2：3，培养箱环境为5％O2，37℃。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤e)去除细胞碎片的方法为5000rpm，30min离心去沉淀，0.22um囊式滤芯过滤。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤f)中添加海藻糖、甘露醇和透明质酸的质量份比例分别为5％、8％、1％。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤g)中的冻干方法如下：

1)添加海藻糖、甘露醇和透明质酸的培养上清为冻干混合原液；

2)分装冻干混合原液至西林瓶，快速预冻，设置预冻温度为-40℃-50℃；

3)待半成品预冻温度达到-40℃-50℃，保温2-5小时；

4)抽真空5-10P，保持温度在-40℃-50℃，至水线完全消失；

5)逐步升高干燥温度，6-10小时后制备成冻干粉成品。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤e)中细胞裂解方法为向含细胞的细胞工厂中加入1L生理盐水，-20℃条件下反复冻融细胞，使细胞裂解。

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