抑菌实验方案

抑菌实验方案
一、菌种
大肠杆菌ATCC25922 金黄色葡萄球菌ATCC6538
二、培养基
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15~20g，用10mol/LNaOH调pH，范围7.0~7.4
倒平板（平板培养基）
1.将培养皿洗净、干燥，使各培养皿盖方向一致，用牛皮纸包好，或放入特制铁罐内，注明皿盖的方向。

高压灭菌或干燥灭菌后备用。

2.取刚灭菌后尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，先左手持三角瓶,右手反转手掌用中指和无名指拨出棉塞或硅胶赛(或不翻转手掌用小指和手掌拨出棉塞) ,同时将三角瓶转换至右手，而后左手拿平皿,以大拇指和中指将皿盖打开一缝，至瓶口刚好伸入。

三角瓶口经火焰烧灼后，倾入灭菌或溶化、冷却至55~60°C的培养基约15mL(勿使瓶口靠在平皿壁上，以免沾染皿壁)，迅速盖好皿盖，置于桌上轻轻旋转平皿,使培养基均匀分布于整个平皿底部,冷凝后即为平板培养基。

有时凝固后的培养基表面有冷凝水，可将平皿盖打开倒置于37℃温箱，除去冷凝水，否则将影响平板分离培养效果。

为防止冷凝水过多，也可将培养基冷却至45 ~ 50°C再倒平板。

培养基在30℃下放置一天，无污染的即可使用。

一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用
三、器械
培养皿（90mm）、滤纸、三角耙、接种环、试管
四、实验步骤
（一）、抑菌圈的测定(滤纸片法)
1、菌种接种
将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌反复转种2次，使菌种新鲜，置30℃恒温培养箱培养1d，备用。

2、菌悬液制备
在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水(约5mL)，接种环轻刮菌落，摇晃混匀。

3、涂布
在超净台里用枪取0.1ml菌悬液注入平板，放置5min左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板
4、贴片
在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用无菌水做对照组,硫酸链霉素(10U)作阳性对照。

每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用镊子夹着滤纸片在样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固，置(正放)4℃冰箱中放24h。

5、培养
24h后放入(倒置)培养箱中培养，30℃培养24h后观察结果。

用尺子测量抑菌圈的直径。

目测并以下列标准记录：“+”表示样品对受试菌有抑制作用，括号内为形成抑菌圈的直径，单位cm；“一”表示样品对受试菌无抑制作用。

(二)、最小抑菌浓度测定(MIC)—试管法
根据滤纸片法所得结果，参照文献对各受试菌种有作用的样品做试管法试验培养基以每管终体积5 m1分装于试管(18mm×180mm)中，在120℃、0.1 MPa条件下灭菌20 min，当灭菌培养基冷却至50℃左右时，无菌操作加入样品充分混匀，倍比稀释成(体积比)系列浓度，无菌水作对照，分别制成斜面。

取生长良好的受试菌划线接种于斜面上。

30℃恒温培养箱中培养24h，观察结果。

目测并以下列标准记录：菌完全无生长“一”；菌生长迟缓，形成的菌落很小“+”：菌生长比较快形成菌落较大“++”；菌生长迅速但菌落比正常小“+++”；菌生长迅速与正常相同“+++十”。

取完全不生长管最低样品浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

需要的试剂和器材：胰蛋白胨、氯化钠、培养皿（90mm）*20个、滤纸、三角耙、试管（18mm×180mm）*20个、弯头小镊子、培养皿灭菌桶（或者用报纸、牛皮纸包扎灭菌也行）。