光甘草定与酪氨酸酶的相互作用模式研究
甘草在皮肤相关疾病的运用药理分析
甘草在皮肤相关疾病的运用药理分析甘草是中医临床各科中最常用的中药之一，具有广泛的药理作用。
其中甘草及其有效成分的抗炎和免疫调节作用、皮质激素样作用、抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用常被皮肤科采用。
为了推动甘草在皮肤病领域中的研究和进一步开发，笔者比较全面分析甘草及其有效成分的皮肤药理作用，供学界参考。
标签：甘草；有效成分；皮肤药理1皮肤药理作用甘草提取物及其黄酮类化合物、甘草酸等对变态反应性皮肤病、皮肤肿瘤、病毒性皮肤病、色素沉着等皮肤病均有药理活性。
由于甘草酸和甘草次酸的化学结构与糖皮质激素相似，它们既是糖皮质激素受体的部分激动拮抗剂，又是糖皮质激素的代谢抑制剂，能对抗应激下调的糖皮质激素受体数量。
最近张剑锋等报道甘草酸二铵（18α-甘草酸的二铵盐）也上调糖皮质激素受体和抗炎介质IL-10的表达，也能抑制HMGB-1表达。
还能竞争性抑制糖皮质激素的各种代谢失活酶活性（如3-酮基甾体还原酶、Δ4-5β-甾体还原酶、20-酮基甾体还原酶及11β-羟基甾体脱氢酶），产生类似激素样抗炎抗变态反应。
正常皮肤组织含有11β-羟基甾体脱氢酶，而患病皮肤含量更高。
甘草次酸和甘草酸都能抑制这种酶的活性，造成更多的有活性的氢化可的松进入皮肤组织产生抗炎抗变态反应，因此单用或与激素合用可以治疗各种皮肤病。
2抗皮肤肿瘤2.1黄酮类化合物皮肤涂抹胀果甘草总黄酮2mg可明显抑制二甲基苯蒽合并巴豆油诱发的小鼠皮肤乳头瘤生成，抑制作用主要在促癌阶段，因为1mg总黄酮还可以抑制巴豆油诱发的小鼠耳肿。
体外实验表明甘草总黄酮（20mg/L）显著抑制巴豆油诱发大鼠中性粒细胞和新生小鼠皮肤表皮细胞的化学发光以及肝线粒体的脂质过氧化反应，说明抗促癌作用与其抗炎、抗氧化作用有关。
甘草查耳酮甲是甘草总黄酮中抑制皮肤乳头瘤生成的活性成分。
光甘草定是一种抗氧化剂，可通过抑制活性氧产生和激活p53，调控BCL-2和聚ADP核糖聚合酶蛋白裂解，对抗紫外线诱导人角质形成细胞产生氧化DNA碎片，防止阳光引起皮肤衰老和皮肤癌。
光甘草定美白原理
光甘草定美白原理
光甘草定的美白原理主要基于以下几个方面：
1. 抑制酪氨酸酶活性：酪氨酸酶是黑色素（melanin）合成过程中的关键酶，光甘草定能够抑制这个酶的活性，从而阻断黑色素的合成，达到美白效果。
2. 舒缓和抗刺激作用：光甘草定能够直接作用在皮肤上，具有舒缓和抗刺激的效果，能够减少由于紫外线、压力、污染等外界因素对皮肤产生的刺激，从而降低黑色素形成的信号。
3. 抑制促黑激素：光甘草定能够抑制促黑激素的活性，从而切断黑色素向表皮转运的途径，使肤色无法变黑。
4. 促进还原黑色素：光甘草定能够促进还原黑色素的形成，从而抵御氧化导致的肤色黯沉。
需要注意的是，虽然光甘草定具有美白效果，但具体效果因人而异。
同时，使用含有光甘草定的护肤品时，需要按照说明书或者医生的建议正确使用，避免产生过敏或者刺激等不良反应。
美容日记 美白黄金-光甘草定
美容日记美白黄金-光甘草定中文名称：光甘草定（光甘草啶）英文名称：Glabridin化学式：C20H20O4分子量：324.37储存方法：2-10℃保存熔点： 156～158℃外观：无色片状结晶性状：光甘草定为淡黄色粉末，不溶于水，易溶于有机溶剂，如丙二醇等。
主要用途：生化学用试剂基因工程学研究用试剂药理作用：光甘草定是光果甘草中的主要黄酮类成分之一。
它在细胞色素P450/NADPH氧化系统中显示出很强的抗自由基氧化作用，能明显抑制体内新陈代谢过程中所产生的自由基、以免受对氧化敏感的生物大分子(低密度脂蛋白LDL,DNA)和细胞壁等被自由基氧化损伤。
从而可以防治与自由基氧化有关的某些病理变化,如动脉粥样硬化,细胞衰老等。
此外，光甘草定尚有一定的降血脂和降血压的作用。
意大利研究还证实Glabridin有抑制食欲的作用，它能减少脂肪却又不减轻体重。
光甘草定在化妆品界：从lycyrrhiza glabra L. (syn. Liquiritae officinalis Moenc., Fani. Fabaccae)的根中提取得到的，用作化妆品原料。
Glycyrrhiza glabra L.系多年生草本植物，生长于欧洲南部、亚洲、地中海地带，在俄罗斯、西班牙、伊朗和印度地区广泛h种植。
G. glabra植株高约1-1.5米，叶片细小显深绿色，花有黄色、兰色、紫罗兰色，根茎尝之有甜味。
光甘草定（美白黄金）\（甘草美白精华素PT-40）能深入皮肤内部并保持高活性，美白并高效抗氧化。
有效抑制黑色素生成过程中多种酶的活性，特别是抑制酪胺酸酵素活性。
同时还具有防止皮肤粗糙和抗炎、抗菌的功效。
光甘草定是目前疗效好、功能全面的美白成分。
光甘草定为日本MARUZEN公司1989年推出的美白化妆品添加剂。
经过多年来的使用，作用明显，安全性好。
是目前国际上高档美白化妆品的主要功效成分。
除日本、韩国的化妆品公司广泛使用外，Lancome、Dior、Sonia Rykiel、Chanel也普遍使用该成分。
光甘草定透皮吸收的影响因素研究
天津中医药大学本科毕业论文光甘草定透皮吸收的主要影响因素的研究学院中药学院专业药物制剂学生姓名赵丽娜学号 201014080099指导教师王艳老师天津中医药大学2013年5月毕业论文诚信声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。
学位论文除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或在网上发表的论文。
特此声明。
论文作者签名：日期：学位申请人：赵丽娜指导老师:王艳授予单位：天津中医药大学答辩日期：目录摘要 (5)Abstract .................................................................................................. 错误！未定义书签。
论文正文 ............................................................................................... 错误！未定义书签。
1绪言 ................................................................................................... 错误！未定义书签。
1.1光甘草定 ........................................................................................ 错误！未定义书签。
1.2 经皮给药系统 ............................................................................... 错误！未定义书签。
2光甘草定透皮吸收实验.............................................................. 错误！未定义书签。
光甘草定 液相
光甘草定（Glabridin）是一种从光果甘草（Glycyrrhiza glabra）中提取的天然化合物，具有抑制酪氨酸酶活性、美白、抗氧化等多种护肤功效。
在液相色谱法中，光甘草定的检测方法主要包括高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱- 质谱法（LC-MS）等。
1. 高效液相色谱法（HPLC）：HPLC 是一种常用的液相色谱技术，可用于测定光甘草定的含量。
样品经过提取、纯化后，进入液相色谱仪进行检测。
HPLC 法具有较高的灵敏度、准确度和分辨率，能够满足光甘草定检测的需求。
2. 液相色谱- 质谱法（LC-MS）：LC-MS 是一种结合了液相色谱和质谱技术的分析方法，可用于光甘草定的定性和定量分析。
通过LC-MS 技术，可以获得光甘草定的质谱信息，从而对其进行鉴定和定量。
LC-MS 具有较高的灵敏度和准确度，适用于复杂样品中光甘草定的检测。
3. 紫外可见光谱法（UV）：紫外可见光谱法是一种简单、快速的光谱分析方法，可以用于光甘草定的定性分析。
通过测量光甘草定溶液在特定波长下的吸光度，可以初步判断样品中光甘草定的存在。
4. 荧光光谱法：荧光光谱法是一种基于光甘草定分子荧光性质的分析方法，可以用于光甘草定的定量分析。
通过测量光甘草定溶液在特定波长下的荧光强度，可以计算出光甘草定的浓度。
光果甘草乙酸乙酯相对酪氨酸酶的抑制作用
光果甘草乙酸乙酯相对酪氨酸酶的抑制作用刘雨萌;李影影;李明静【摘要】酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶,实验以光果甘草为原料,研究其提取物乙酸乙酯相对酪氨酸酶活性的抑制作用及机理.采用L-多巴速率氧化法体外测定光果甘草提取物乙酸乙酯相对酪氨酸酶的抑制活性,并绘制了Lineweaver-Burk 双倒数曲线以此判断其抑制类型.结果表明光果甘草提取物乙酸乙酯相半抑制浓度(IC60)为(266.5±1.4) mg/L.对酪氨酸酶抑制机理测定分析的结果表明,光果甘草提取物乙酸乙酯相对酪氨酸酶活性的抑制作用表现为可逆抑制,对酪氨酸酶活性的抑制类型是混合型抑制,抑制常数KI为(182.86±1.43)mg/L,α值为(15.49±0.68) mg/L.可见甘草提取物乙酸乙酯相对酪氨酸酶有较强抑制作用.【期刊名称】《化学研究》【年(卷),期】2015(026)003【总页数】5页(P270-274)【关键词】光果甘草;酪氨酸酶;抑制动力学【作者】刘雨萌;李影影;李明静【作者单位】河南大学化学化工学院,河南开封475004;河南大学化学化工学院,河南开封475004;河南大学化学化工学院,河南开封475004;河南大学河南省天然药物与免疫工程重点实验室,河南开封475004【正文语种】中文【中图分类】TS202.3甘草中主要活性成分有三萜类化合物、黄酮类化合物和多糖类化合物[1-3].甘草酸和光甘草定是光果甘草中的两种主要活性成分.目前发现,光甘草定是存在于光果甘草中异黄酮类成分,可清除自由基和抑制酪氨酸酶,阻止黑色素的形成.有实验表明,光甘草定能较强地抑制酪氨酸酶的活性同时具有体外抗氧化的作用[4].目前,美白化妆品主要是以抑制酪氨酸酶的活性而发挥美白作用[5].此前这种功效成分不能兼具功能性与安全性,例如一些含汞化合物、对苯二酚等被禁止在化妆品中使用[6-7].近年来,人们新发现了许多抑制酪氨酸酶的活性成分,例如熊果苷、果酸、曲酸、VC衍生物及一些中药提取物等[8-11].这些活性成分功能性好、副作用较小,已经成为大家关注与研究的焦点.美白抑制剂不仅被应用在化妆品行业,还被研究治疗色素沉着过度引起的皮肤病等.然而与光甘草定相比,以上的部分美白成分在长期使用过程中依然会产生毒副作用,例如在使用含有较高浓度果酸的化妆品时,长时间的阳光照射可能会引起皮肤癌;高浓度的曲酸有一定的细胞毒性,如果长期使用可能会影响试验动物器官的结构和功能,甚至引起癌症.光甘草定是天然的美白剂,安全性较高,作用温和,有“美白黄金”之称.据文献报道光甘草定在二氯甲烷、乙酸乙酯等有机溶剂中的溶解性较好[12],但是由于二氯甲烷的毒性太大,故选用乙酸乙酯为溶剂提取甘草中的光甘草定,研究其对酪氨酸酶活性的抑制作用,并探究其抑制动力学类型,为光果甘草提取物及其他美白成分的开发应用提供理论参考.光果甘草:由洛阳蓝斯利科技有限公司提供;光甘草定标准品:课题组提供,经鉴定纯度在96%以上;酪氨酸酶(505 U/mg)、L-酪氨酸、L-多巴:上海宝曼生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯试剂;实验用水为二次蒸馏水.JHBE-50S型闪式提取器:北京金鼎科技发展有限公司;DNM-9606型酶标分析仪:北京普朗新技术有限公司;PL601-L型电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;电子分析天平:北京赛得利斯天平有限公司;LRH-400-GSI型珠江牌培养箱:韶关市泰宏医疗器械有限公司;RE-2000B型旋转蒸发器:巩义市予华仪器有限公司;DHG 型电热恒温鼓风干燥箱:郑州国瑞仪器有限公司.1.3.1 样品制备将光果甘草粉碎,过60目筛.本课题前期已考察过采用闪式提取法同时提取甘草酸和光甘草定的提取工艺,本实验采用经考察确定的最佳提取工艺.称取20 g光果甘草粉末,提取溶剂为氨性醇溶液(体积分数为70%的乙醇+体积分数为0.5% 的氨水+体积分数为29.5%的水),料液比为1∶25(g/mL),提取电压为95 V，单次提取时间为2 min,过滤后的滤渣再在相同条件下用500 mL上述溶剂提取，如此提取3次,合并提取液并浓缩,平行提取3份,每份提取液最终浓缩至150 mL.再用等体积乙酸乙酯萃取提取液(每份提取液萃取3次)得到乙酸乙酯相,蒸去乙酸乙酯至粘稠浸膏状,低温干燥后称量得浸膏质量,最后用二甲基亚砜溶解定容至50 mL的容量瓶中,待用.所配溶液中乙酸乙酯相的浓度为(39.59 ± 0.05) g/L.1.3.2 酶实验波长的选择本实验采用酶标分析仪测定L-多巴经酪氨酸酶催化生成的多巴醌的吸光度[13-14],多巴醌的紫外全波长扫描图如图1所示，此酶标分析仪(DNM-9606)只可设4个固定波长,即405、450、492和630 nm.由图1可知,多巴醌在478 nm 处有最大吸收,但是此吸收峰较宽,在478 nm 处测定的吸光度值与492 nm 处测定的吸光度值相差不多,因此选择492 nm 作为测定波长.1.3.3 乙酸乙酯相对酪氨酸单酚酶活力的影响向96孔酶标板中加入不同量的抑制剂(乙酸乙酯相用二甲基亚砜溶解，磷酸盐缓冲液稀释,二甲基亚砜终体积为3%)、20 μL的L-酪氨酸(10 mmol/L)和75 μL酪氨酸酶(4 mmol/L),用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.5)补偿反应体系的终体积为200 μL.混匀后在37 ℃条件下每隔60 s测其在492 nm下的吸光度值.由曲线的直线部分线性回归得直线斜率求得稳态的酶相对活力,反向延长直线部分至横轴，截距为酶促反应的时间[15].1.3.4 乙酸乙酯相对酪氨酸酶抑制活性影响称取0.39 g的L-多巴，用磷酸盐缓冲液定容至200 mL,称取 0.0158 g酪氨酸酶(避光保存)，用磷酸盐缓冲液(pH=6.5)定容至50 mL.以10 mmol/L L-多巴为底物，向96孔酶标板中加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.5)、20 μL L-多巴(10 mmol/L)、不同体积的乙酸乙酯相和75μL酪氨酸酶(4 mmol/L),反应混合物的体积共计为200 μL.置于37 ℃人工气候箱中10 min后,立刻测492 nm下的OD值.用酶抑制率公式计算酪氨酸酶的抑制率：其中,Aa是加酪氨酸酶不加提取液,只加多巴溶液时的吸光度;Ab是加酪氨酸酶不加提取液,不加多巴溶液时的吸光度;Ac是加酪氨酸酶加提取液和多巴溶液时的吸光度;Ad是加酪氨酸酶加提取液,不加多巴溶液时的吸光度.使用GraphPad Prime 5.0 软件求得酪氨酸酶被抑制一半时抑制剂的浓度,即样品的IC50值.1.3.5 乙酸乙酯相对酪氨酸酶抑制机理的判断固定加入的L-多巴(10 mmol/L)的体积为20 μL,改变加入的酪氨酸酶的量,测定不同浓度的乙酸乙酯相溶液对酪氨酸酶催化L-多巴的反应的影响[16-17].以酶催化L-多巴的氧化活力对酪氨酸酶浓度作图[18],如果得到一族通过原点的直线则为可逆抑制,如果得到一族平行的直线则为不可逆抑制，以此来判断该反应是否可逆.1.3.6 乙酸乙酯相对酪氨酸酶抑制类型固定加入的酪氨酸酶(4 mmol/L)为75 μL,改变加入的L-多巴的量,测定不同浓度的乙酸乙酯相溶液对酪氨酸酶催化L-多巴反应的影响[19-22].采用Lineweaver-Burk双倒数法判断该反应的抑制类型，如果得到一组相交于横轴的直线则为非竞争型抑制,如果得到一组相交于纵轴的直线则为竞争型抑制,如果得到一组相交于第二或第四象限的直线则为混合Ⅰ型和混合Ⅱ型抑制,如果得到一组平行的直线则为反竞争型抑制.以L-多巴为底物,乙酸乙酯相对酪氨酸酶的抑制作用进程曲线如图2所示.反应开始后,产物多巴醌的生成量先缓慢的上升,反应到达一定程度后成直线上升,体系达到稳定.以稳定态酶相对活力和迟滞时间对乙酸乙酯相的浓度作图(图3),随着乙酸乙酯相浓度的增加,稳定态酶相对活力逐渐下降,迟滞时间逐渐增加.没有加入乙酸乙酯相时,迟滞时间为51 s,当乙酸乙酯相的浓度达到570 mg/L时,稳定态酶相对活力下降至45.79%,迟滞时间增加至144 s,增加了2.82倍.酪氨酸酶抑制率对样品浓度关系曲线见图4.由图可见，随着样品浓度的增大,对酪氨酸酶的抑制作用越来越大,即酶的活力大幅下降,表明甘草乙酸乙酯相对酪氨酸酶有较强的抑制作用；当样品浓度为89~133 mg/L时对酶的抑制率较低,酶活力降幅较小,不到15%；当样品浓度为133~312 mg/L时,对酪氨酸酶的抑制率逐渐增加；测定抑制率为50% 时所需样品的浓度(即IC50)为(266.5±1.4) mg/L,n=3. 剩余酶活力对酪氨酸酶量变化关系曲线如图5所示,得到的是一族交于原点的直线,横、纵轴截距均不随着样品浓度的变化而变化.随着样品浓度的增大,得到的直线的斜率减小，表明样品对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用表现为可逆抑制，说明光果甘草乙酸乙酯相对酪氨酸酶二酚酶的作用是通过抑制酪氨酸酶的活力而使酶对多巴的催化作用减弱,而不会导致酶不可逆失活.如图6所示,固定酪氨酸酶的加入量,改变L-多巴的加入量,得到一族交于第二象限的直线,横、纵轴截距都随着样品浓度改变而改变.由图可得样品的浓度变化,米氏常数和最大反应速率也会随之改变，样品浓度增大,米氏常数随之增大,最大反应速率随之减小.结果表明光果甘草乙酸乙酯相对酪氨酸酶二酚酶抑制类型为混合型抑制.这种作用类型与一些芳香酸,如对苯二甲酸,对酪氨酸酶的抑制作用相似.再以双倒数图的三条曲线的纵轴截距和直线斜率对乙酸乙酯相浓度分别作图,最后得到对游离酶的抑制常数KI为(182.86 ±1.43)mg/L,α值为(15.49± 0.68) mg/L.说明乙酸乙酯相对酶-底物络合物抑制作用强度是对游离酶抑制作用强度的15.49倍.据文献报道[23],光甘草定的抑制机理为竞争型抑制,它只与自由酶结合,减少多巴与酶的结合,从而减少黑色素形成.酪氨酸酶是黑色素形成的限速酶,酪氨酸酶抑制剂在化妆品、医药和食品等领域具有非常广泛的用途.本实验用乙醇水溶液提取光果甘草,并用乙酸乙酯萃取光果甘草提取液.以L-多巴为底物,研究光果甘草乙酸乙酯相对酪氨酸酶的抑制作用,其IC50值为266.5 mg/L.结合动力学分析，光果甘草乙酸乙酯相对酪氨酸酶的抑制作用是通过抑制酶活力而使酶的催化作用减弱,抑制类型是混合型抑制,乙酸乙酯相可与酶和酶-底物络合物结合,但是乙酸乙酯相与酶-底物络合物的结合没有与游离酶的结合牢固.为进一步将光果甘草乙酸乙酯萃取物与其他美白成分进行复配应用研究奠定基础.【相关文献】[1] 高雪岩,王文全,魏胜利,等.甘草及其活性成分的药理活性研究进展[J].中国中药杂志,2009,34(21):2695-2700.[2] 李薇,宋新波,张丽娟,等.甘草中化学成分研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2012,14(7):40-43.[3] 胡金锋,沈凤嘉.甘草属植物化学成分研究概况[J].天然产物研究与开发,1996,8(3):77-91.[4] YI S 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光果甘草地上部分中光果甘草定的含量测定
光果甘草地上部分中光果甘草定的含量测定【摘要】目的：建立测定光果甘草地上部分中光甘草定含量的测定方法。
方法∶采用高效液相色谱法进行测定。
结果∶地上部分光甘草定含量在0.08402-0.4201mg/ml范围内,峰面积值与浓度有良好的线性关系（r=0.998）。
结论∶该方法简单、结果准确，适用于光果甘草地上部分光甘草定的含量测定。
【关键词】光果甘草地上部分光甘草定含量测定光果甘草(Glycyrrhiza.glabra L.)为豆科 (Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza L.)多年生植物[1]。
在我国主要分布在新疆。
其地下部分为一种传统中药，是提供甘草甜素和甘草酸的主要原料植物之一，光甘草定(Glabridin)是光果甘草中的主要异黄酮类成分之一，也是研究最多的甘草黄酮之一；因其具有美白和高效抗氧化的能力，在国际上被用于高档美白化妆品中，素有“美白黄金”之称[2-4]。
与光甘草定生物活性最相关的研究主要为其抗炎、抗动脉粥样硬化、雌激素类似作用和能量代谢调控[5-8]，而这一切活性主要源于其能下调细胞内活性氧水平、与抗氧化效应物结合、作用于雌激素受体并可能作为一种植物来源的选择性雌激素受体调节剂。
有文献比较了光果甘草叶和根乙醇-水溶液提取物的总黄酮含量、抗氧化性、和酪氨酸酶抑制活性，结果发现光果甘草叶在物质含量和生物活性两方面均表现出一定的优势[5]，为后续研究甘草叶成分奠定基础。
但总体而言，地上部分资源的开发和利用研究相对要少，尤其是尚没有文献报导关于其地上部分光果甘草定提取和含量测定的报导。
本文仅对光果甘草的地上部分的光果甘草定的含量进行了测定分析，为进一步开发光果甘草地上部分资源提供参考依据。
1.材料、仪器和试剂1.1材料及处理来自麦盖提引种种植的三年生光果甘草8月份采的地上部分，阴干。
高速粉碎机分别粉碎，过 40 目筛，装于密封样品袋中室温下储存于干燥器中待用。
1.2 仪器设备UV-2350型紫外可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）；日本岛津液相色谱仪：配SPD-20A紫外检测器、Cosmosil C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱、CTO-20A柱温箱、LC-20AD泵、SIL-20A自动进样器；RE-5205旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；ME104T电子天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）；高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；40目标准药典筛（上虞市仪器设备厂）；SHZ-III型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；DZF型真空干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司）；索式提取器。
光甘草定的制备及其对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用
（ ｌ ｇ ｆＰ ａｍａ ｙ， ｈｈ ｚ Ｕｎｖ ｒｉ ／ ｙ Ｌ ｂ ｒ ｔｒ ｆＸｉｊ ｎ ｙ ｏ ｄｃｎ ｓ ｕ ｃ ｓ Ｓ ｉｅｉ ３ ０ ２， ｉａ Ｃｏｌ ｅｏ ｈ ｒ ｃ Ｓ ｉｅｉ ｉｅ ｓｔ Ｋｅ ａ ｏ ａｏ ｙｏ ｎｉ ｇＰｈ ｔｍｅ ｉｉｅＲｅ ｏ ｒｅ ， ｈｈ ｚ ２ ０ Ｃｈｎ ） ｅ ｙ ａ ８ Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｉ ｈｅ ｐ ｅ ｅ ａ ｅ ， ｏ ｏｐ ｎｏ ａ ｅ ａ ｄ ｄ ｐ ｎ ｌ ｓ ｒ ｈｏ ｅ ｓｓ ｂｓ ｒ ｔ ｅ ｐｅ ｔｖｅｙ． ｓ ｒ ｃ ： ｎ ｔ ｒ ｓ ｎｔｐ ｐ ｒ ｍ ｎ ｈｅ ｌ ｓ ｎ ｉ ｈｅ ｏ ａ ｅａ ｅ ｃ ｓ ｎ ａ ｕ ｔ ａ ｅｒ ｓ ｃ ｉ ｌ Ｔｈｅｉ ｎ— ｈｉ ｉｉ ｆｔ ｒ ｉ ａ ｅ ｉ ｎ ｓ ｉ ｔ ｄ ｂｙ ｇ ａ ｉ ｉ ｂ ｔｏｎ ｏ ｙ ｏｓｎ ｓ ｓｉ ｖｅ ｔｇａ ｅ ｌ ｂｒｄ ｎ ｗｈｉｈ ｉ ｓ ａ ｅ ｈｅｇｅ ｉｉａ ｃ ｕ ｎ ｃ ｒ ｍ ａ ｏ ａ ｙ ｃ ｓｉｏｌｔ ｄ ｂｙ ｔ ｌｓｌｃ ｏｌ ｍ ｈ ｏ ｔ ｇ ０ ０ ０ —４ ８０ １ ０ — ３ ３ ２ １ ） ４０ ７ — ５
光 甘 草 定 的 制 备 及 其 对 蘑 菇 酪 氨 酸 酶 的 抑 制 作 用
骆 从 艳 ， 春 海 ， 园姬 ， 超 鹏 ， 文 慕 王 李 陈
（石 河 子 大 学 药 学 院／ 疆 特 种植 物药 资源 重 点 实 验 室 ， 河 子 ８ ２ ０ ） 新 石 ３０ ２
甘草黄酮对酪氨酸
从图中可以看出F0/F与[Q]有一个很好的线性关系，说明淬灭过程是一个 单一的程序：动态淬灭或静态淬灭。荧光分子的平均寿命τ0为10–8s，根据 KSV的值可求出kq的大小，各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞速率常数 为2.0×1010 L•mol–1•s–1，本实验测得kq为 2.66 × 1012L/mol/s。其远大于 2.0×1010 L•mol–1•s–1，故其为静态淬灭。这说明一个稳定复杂的甘草黄酮 与酪氨酸酶作用的生成。
根据下图求得Ki值。
酶的分析验证
荧光淬灭分析
荧光淬灭：是指导致特定物质的荧光强度和寿命减少 的所有现象。荧光猝灭法已被广泛应用于研究配体和 蛋白质之间的相互作用。荧光猝灭法进一步研究光甘 草定和酪氨酸酶之间的相互作用。 静态猝灭：基态荧光分子与猝灭剂之间通过弱的结合 生成复合物，且该复合物使荧光完全猝灭的现象称为 静态猝灭。 动态猝灭：激发态荧光分子与猝灭剂碰撞使其荧光猝 灭则称为动态猝灭。
随着甘草黄酮量的不断增加，酪氨酸酶的荧光强度下降，但是峰值未改 变，这说明甘草黄酮与酪氨酸酶之间的交流未影响酪氨酸酶的空间结构。
Stern–Volmer 方程用于分析荧光淬灭数据。
F0是无抑制剂的荧光强度； F是有抑制剂的荧光强度； KSV淬灭常数； Kq淬灭率常数； Τ0 无抑制剂的荧光平均寿命； [Q ]为抑制剂的浓度。
研究背景
甘草黄酮已被证明可以抑制小鼠黑色素瘤细胞中酶的活性。 甘草 黄酮是对人黑素细胞G361无细胞毒性，甘草黄酮比曲酸对酶有更好的 抑制作用，也已被证明。 在多细胞生物的甘草黄酮安全数据仍然缺乏，这些相互作用的分 子机制仍不清楚。 本实验采用斑马鱼模型作为体内实验来对其抑制作用和安全性进 行评价。
响应面法优化高效美白霜功效成分配比
响应面法优化高效美白霜功效成分配比陈丹;魏天宝;吴培诚;洪延涵;闻庆;刘卫【摘要】通过优化美白功效成分配比,为开发高效美白霜提供试验依据.以酪氨酸酶抑制率和自由基清除率为评价指标,通过响应面试验设计,优化不同美白功效成分的复合配比,制备高效美白霜.模拟最大化意愿预测结果,获得最佳的功效成分质量配比为m(α-熊果苷)︰m(光甘草定)︰m(Vc乙基醚)︰m(烟酰胺)=269.8︰2.23︰231.9︰104.5,此复配比例下的酪氨酸酶抑制率为95.81％,自由基清除率为86.17％.试验结果表明,用响应面法模拟预测的酪氨酸酶抑制率、自由基清除率与实测值重合性好,响应面法可有效应用于高效美白霜中功效成分配比的研究.【期刊名称】《香料香精化妆品》【年(卷),期】2019(000)004【总页数】8页(P65-71,76)【关键词】响应面设计法;高效美白霜;酪氨酸酶抑制率;自由基清除率【作者】陈丹;魏天宝;吴培诚;洪延涵;闻庆;刘卫【作者单位】武汉百思凯瑞生物科技有限公司,湖北武汉 430075;华中科技大学生命科学与技术学院,湖北武汉 430074;华中科技大学国家纳米药物工程技术研究中心,湖北武汉 430075;广东药科大学基础学院,广东广州 510006;武汉百思凯瑞生物科技有限公司,湖北武汉 430075;武汉百思凯瑞生物科技有限公司,湖北武汉430075;华中科技大学生命科学与技术学院,湖北武汉 430074;华中科技大学国家纳米药物工程技术研究中心,湖北武汉 430075【正文语种】中文由于工作、生活压力的增加和自然环境日趋恶劣，皮肤暗黄、色素沉着等不良症状越来越多见，因此，美白祛斑化妆品越来越受到人们的青睐。
皮肤中的黑色素含量决定了肤色的深浅，酪氨酸酶被视为黑色素合成过程中的关键酶与限速酶，抑制该酶活性直接影响黑素合成速率与数量[1]。
氧自由基可诱导皮肤角质层释放α - 黑素细胞刺激素等因子，从而促进黑素合成[2]。
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Pharmacy Information 药物资讯, 2018, 7(6), 152-157Published Online November 2018 in Hans. /journal/pihttps:///10.12677/pi.2018.76025Study on the Interaction Modeof Glycyrrhizin and TyrosinaseJuan Sun1, Yongan Yang1, Hailiang Zhu2, Hui Zhong11Jiangsu Nature Bioengineering Technology Co., Ltd., Zhenjiang Jiangsu2Nanjing University Lianyungang High-tech Research Institute, Lianyungang JiangsuReceived:Oct. 25th, 2018; accepted: Nov. 8th, 2018; published: Nov. 16th, 2018AbstractEvaluating the effect and mechanism of Glycyrrhizin on Tyrosinase activity in human melanoma cells is in order to provide theoretical basis for the application of Glycyrrhizin in the field of whi-tening. The theoretical simulation was carried out by computer-assisted drug design software, and the melanoma cells (A375) were used as the model to determine the whitening effect by MTT as-say. Furthermore, we evaluated the Tyrosinase activity by human Tyrosinase enzyme-linked im-munoassay kit. The results exhibited that Glycyrrhizin has a significant inhibitory effect on Tyro-sinase and melanoma cells. The mechanism may be due to the interaction with Histidine and Phe-nylalanine in the active center of Tyrosinase, therefore, Glycyrrhizin could be perfectly chimeric at the enzyme active site to exert an inhibitory activity.KeywordsGlycyrrhizin, Tyrosinase, Melanoma Cells, Computational Simulation光甘草定与酪氨酸酶的相互作用模式研究孙娟1，杨永安1，朱海亮2，钟慧11江苏耐雀生物工程技术有限公司，江苏镇江2南京大学连云港高新技术研究院，江苏连云港收稿日期：2018年10月25日；录用日期：2018年11月8日；发布日期：2018年11月16日摘要评价光甘草定对人黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的影响及探讨其机理，为光甘草定在美白领域的应用提供理论依据。
实验借助计算机辅助药物设计软件对光甘草定与酪氨酸酶作用模式进行理论模拟计算，以人黑色素瘤细胞(A375)为模型，采用MTT法测定光甘草定对黑色素细胞活力的影响，基于人酪氨酸酶联免疫试剂盒测定细孙娟等胞内酪氨酸酶活性。
实验结果显示，光甘草定有显著抑制酪氨酸酶活性及抑制黑色素细胞的作用，其作用机制可能是由于与酶活性中心的组氨酸及苯丙氨酸形成相互作用力，从而完美的嵌合在酶活性位点发挥抑制作用。
关键词光甘草定，酪氨酸酶，黑色素瘤细胞，计算模拟Copyright © 2018 by authors and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY)./licenses/by/4.0/1. 引言光甘草定是甘草黄酮的一种[1]，是世界上最昂贵的天然祛斑美白成分，也是世界上公认的最安全的祛斑美白成分。
黑色素是一种生物色素，人类皮肤的颜色主要取决于黑色素的含量与分布[2]。
酪氨酸酶是黑色素生成过程中的关键限速酶。
研究表明，通过抑制机体中酪氨酸酶的活性，能显著减少黑色素的生成，从而达到淡斑美白的效果[3]。
光甘草定能显著抑制酪氨酸酶活性，Yokota T.等通过研究发现，光甘草定在0.1到1.0 μg/mL浓度范围内，对小鼠B16黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶有抑制作用，并通过实验证明这种抑制作用是由于降低了酪氨酸酶T1和T3的活性实现的[4]。
郑秋生等过体外和体内模型研究光甘草定对小鼠黑色素瘤细胞增殖的抑制作用及其分子机制，并发现其诱导细胞凋亡的机制可能与调控糖酵解相关基因的表达有关[5]。
另有报道，陈文等以单酚酶和二酚酶为底物，测定光甘草定对酪氨酸酶活性的影响及体外抗氧化作用。
他们认为光甘草定通过抑制酪氨酸酶和清除自由基来达到美白肌肤的作用[6]。
光甘草定美白的功效虽然很早就被发现，但在国内外研究中，结合计算机辅助药物设计软件来探讨光甘草定对酪氨酸酶抑制活性机制的研究却很少。
因此，本实验中，首先利用Discovery studio 3.5软件与人酪氨酸酶(PDB:5m8t)进行模拟对接，发现潜在作用结合模式。
并利用本公司分离得到的光甘草定评价其对人黑色素瘤细胞及酪氨酸酶的抑制作用，从而对其美白效果和安全性进行综合性的评价，为进一步的开发和应用提供参考。
2. 材料和仪器2.1. 主要药品与试剂光甘草定(江苏耐雀生物工程技术有限公司，纯度为：40%，90%)；人黑色素瘤细胞A375 (南京大学友情提供)；PRMI 1640培养基(GIBCO公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；人酪氨酸酶ELISA酶联免疫试剂盒(Bio-Swamp公司)；噻唑蓝MTT (江苏晶美生物科技有限公司)；二甲基亚砜(阿拉丁试剂公司)。
2.2. 主要仪器Spectra Max190全波长酶标仪，Thermo3131二氧化碳培养箱；奥林巴斯GX51倒置显微镜；上海智诚ZHJH1112B超净工作台。
3. 实验方法3.1. 计算机辅助药物设计本研究选用的计算机模拟软件为DS 3.5 (Discovery Studio 3.5, Accelrys, Inc., San Diego, CA)。
用画图软孙娟等件ChemBioDraw画出光甘草定的结构，保存其为cdx格式文件，利用ChemBio 3D中的MMFF94力场对小分子的三维构象和能量进行优化，保存为mol格式文件。
从蛋白数据库(简称PDB)下载人酪氨酸酶蛋白(PDB: 5m8t; https://)，进行去水加氢操作，准备蛋白分子。
设置对接区域的中心坐标为120.892，277.987，217.11 (X，Y，Z)，区域半径为12Å。
使用DS3.5软件中的CDOCKER板块[7]，CDOCKER是一个基于CHARMm的半柔性分子对接工具，进行小分子与蛋白活性中心进行对接。
具体操作步骤如下：1) 采用高温分子动力学与不同的随机种子产生一系列配套构象。
2) 通过配体指向到受体活性位点的指定位置并进行一系列的随机旋转，产生随机构象。
直至获得所需数目的低能量构象。
3) 对每个最终构象，它们的CHARMm 能量以及单独的相互作用能力被计算出来，根据能量值对构象进行排序和保留。
定义整个靶点蛋白结构域为受体，根据原配体的结合位置选择位点球体所在的位置，除去原配体并将需要结合的配体填充进去，以此来进行分子对接的过程。
根据分子对接的得分情况进行排序，保留每个配体前十位的分子对接构象，具有最大的负CDocker 能量的构象被选为最佳构象。
3.2. 细胞培养人黑色素瘤细胞培养于1640培养液中，放置于37℃、5%二氧化碳培养箱，待细胞长满培养瓶底后在无菌的环境下先倒掉原培养液，再用PBS缓冲液冲洗几次，最后用配制好的胰蛋白酶消化。
待消化好弃去胰酶液体，加入少许新鲜培养液终止消化，轻轻吹打，使得细胞处于单个分散的状态。
收集细胞离心，弃去上层液体，再加入一定量的培养液，轻轻吹打使细胞呈单个分散状，并使用细胞计数板计数。
用培养基将细胞调整至适当浓度，接种于细胞板放入培养箱培养[8] [9]，每一次实验应采用同一传代细胞。
3.3. 药物处理光甘草定和Vc首先用DMSO助溶，然后用蒸馏水稀释，要保证DMSO的最终加入浓度低于0.1%。
现配现用，待测药物浓度和Vc浓度分别为：12.50，25.00，50.00，100，150，200 μM。
3.4. MTT法检测黑色素瘤细胞A357的增值在96孔细胞板每孔中分别加入90 µL含有人黑色素瘤细胞的培养液，待细胞稳定生长并占每孔底部面积80%左右时加入待测药液。
每个待测药物的浓度设3个平行，三次重复实验。
实验组分为：空白对照组(90 µL培养液)、阴性对照组(90 µL含细胞的培养液)、阳性对照组(90 µL含细胞的培养液和10 µL 不同浓度的Vc溶液)待测药物实验组(90 µL含细胞的培养液和10 µL不同浓度的光甘草定)。
将加药后的细胞板放置二氧化碳培养箱(温度为37℃，CO2浓度为5%)进行培养。
培养24 h后，向待测96孔板每孔各加入配好的MTT液10 μL，轻轻振荡混匀，继续在特定条件的培养箱中进行培养4 h。
随后弃去96孔板上清液，每孔再加入150 μL的DMSO，充分震荡数分钟，于酶标仪570 nm波长处测定各孔的光吸收(OD值) [10]。
根据所测的各孔OD值使用SPSS软件[11]计算待测药物的IC50 (IC50为半数抑制浓度)。
3.5. 人黑色素瘤细胞中酪氨酸酶活性测定实验具体操作步骤参照人酪氨酸酶ELISA酶联免疫分析试剂盒使用说明书。
4. 实验结果4.1. 光甘草定与酪氨酸酶计算模拟对接结果我们利用DS3.5软件进行了光甘草定与人酪氨酸酶活性位点的模拟对接，其理论活性值很高，CDOCKER_INTERACTION_ENERGY值为−32.6878。