液相色谱柱基质材料的发展

液相色谱柱基质材料的发展

摘要:色谱柱是色谱分离的核心,色谱基质填料是色谱界研究的热点。与气相色谱相比较,液相色谱可分析检测的有机物范围广泛,可以满足80%有机物的检测,为了方便迅速地选择适合的色谱柱,综合了解液相色谱分离基质材料(填料及整体柱)的分类及表征手段是十分必要的。

关键词:液相色谱基质材料发展

高效液相色谱的基质材料包括填料和整体柱材料,填料可分为无机基质填料和有机基质填料,无机基质填料包括硅胶、氧化铝、氧化锆、羟基磷灰石、氮化物以及活性碳等。此外还有复合物材料,即通过精细调控技术制备的无机-有机球杂交基球,经化学衍生后,制备得对药物分析和筛选很有用的高效、可耐pH2～8、低吸附性的新型填料。

在吸附色谱中,硅胶、氧化铝、活性炭和聚酰胺应用最为广泛。其中活性炭柱色谱尤其适用于分离水溶性物质,如氨基酸、糖类以及某些苷类,它是分离水溶性物质的主要吸附材料之一。聚酰胺也称为锦纶或尼龙,其吸附机理主要来自聚酰胺内的酰胺键,可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键,例如,聚酰胺树脂可以吸附保健品中具有羟基、羧基或酚羟基的黄酮类化合物。

在离子交换色谱中,离子交换树脂主要是利用高分子化学的加聚

反应。一般首先合成高分子离子交换树脂的骨架,然后在骨架上添加功能基。如果需要得到大孔树脂,则在聚合过程中加入致孔剂,如果不添加致孔剂,则得到凝胶型树脂。在高分子离子交换树脂中,骨架多数采用交联度为1%～20%范围的聚苯乙烯,它由二乙烯苯交联制得,结构稳定,通过磺化反应可制备强酸性阳离子树脂;通过氯甲基化后,再与各种胺反应,可得到各种阴离子树脂。少数离子交换树脂的骨架可由交联聚丙烯酸类树脂构成。

在亲和色谱中,固定相由载体、键合臂和具有特殊选择性的亲和基团组成,该亲和基团称为配基。常见的载体有琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺和硅胶等。配基有两大类,第一类是具有专一亲和力,如抗原与其对应的抗体。另一类是没有专一亲和力的假亲和色谱,这类配基典型的代表是染料配基和硼酸盐配基。其中,免疫球蛋白IGG的检测过程中使用的蛋白柱即是一种亲和色谱柱,免疫球蛋白IGG与蛋白柱之间的亲和作用及洗脱过程是通过流动相中的pH值、离子强度及化学组成来控制的,该类亲和色谱柱易滋生霉菌,因此柱子的存储十分重要,比如蛋白柱就需要保存在20%的乙醇的水溶液中,并冷藏于4℃环境。

纵观几大分离色谱,大多数具有特异分离效果的色谱材料均是复合型色谱填料,以下重点介绍的是制备型及分析型液相色谱柱色谱填料的种类、整体柱及色谱基质的表征手段。

1 基质填料种类

1.1 硅胶

无机基质材料中最重要的是硅胶,微粒型硅胶的出现,促进了高效液相色谱法的发生与发展。用作色谱填料基质的硅胶是通过人工合成的,其制备方法多样,大都拥有各自的专利。合成色谱用硅胶区别于天然晶体二氧化硅,也区别于介于晶型和无定型之间的用于色谱、电色谱中的石英毛细管,用作色谱填料的是无定型二氧化硅。硅胶吸附色谱是色谱中的经典,硅胶至今仍是制备色谱中填充柱的主要材料,250目～400目(即40μm～63μm直径)的硅胶颗粒的含水量直接影响活性,其活性随着含水量的升高而降低。当其含水量接近20%的时候,硅胶基本不具吸附活性;活性太高,则出现不可逆吸附和拖尾,甚至分离物分子结构的改变。以下将重点介绍其化学修饰及聚合物包覆的过程。

硅胶能用于色谱基质材料,是因为其表面具有重要的活性基团硅羟基,即自由硅羟基,或称孤立硅羟基。由于游离的硅羟基是造成色谱峰尤其是碱性溶质拖尾的主要原因,因此在合成反相色谱材料中,针对硅羟基的封尾技术非常重要。例如C18柱,在键合了十八烷基后,还需通过小分子的硅烷化试剂(例如三甲基氯硅烷)对其进行封尾,以尽可能地减小极性大的硅羟基对整体呈现非极性的色谱柱的影响,如若硅羟基外露,封尾不完全,势必影响反相色谱的保留时间和色谱峰型。

对硅胶表面进行的改性是通过该活性基团进行的,通过各种硅烷

化试剂对硅胶表面进行修饰,可以得到包括烷烃和芳烃在内的烷基反相填料。常用的硅烷化试剂除了氯硅烷和烷氧基硅烷外,还有烷基硅氨烷。例如:在硅羟基上键合十八烷基,可制得液相色谱柱中常用的C18柱(ODS);以氨基、羧基、磺酸基修饰,可得到离子交换填料;以聚乙二醇修饰,可得到疏水作用的填料。对于化学键合相硅胶,在孔径、粒径相当的前提下,稳定性是其最重要的指标,稳定性主要指柱流失。柱流失的程度取决于键合反应时的条件是否控制得当,即是否由于水的存在,而生成易溶于有机相中的副产物;值得指出的是,在硅胶的预处理过程对最终硅胶基质填料的稳定性也有十分重要的影响,在预处理过程中,需要无机酸浸泡,以除去硅胶表面存在的会造成峰型拖尾,甚至不可逆吸附强极性杂质的Na+、Ca2+、Al3+、Fe3+等金属离子。

1.2 氧化铝

用作吸附材料和色谱填料基质的氧化铝主要是γ-氧化铝,γ-氧化铝表面化学修饰比硅胶更困难,因此氧化铝多使用于一些小分子有机化合物的分离,用于正相、离子交换色谱和反向高效液相色谱中,在生化分离上应用得少。氧化铝的化学修饰可通过铝羟基的反应或是涂覆技术。通过铝羟基反应可通过在氧化铝表面上的活性羟基键合C4、C8和C18等烷基,制得在宽pH范围内稳定,应用于反相色谱中的烷基化氧化铝。表面涂覆可以制得聚苯乙烯-二乙烯基、聚丁乙烯或十八烷基硅烷等强疏水性复合材料。

在吸附型制备色谱中,氧化铝的吸附能力比硅胶更强,氧化铝比硅

胶的样品处理量更大,根据含水量大小(0%～15%),大多情况下,需要控制的含水量为6%～10%,对应的活性为第三和第四等级。根据酸碱性,应用于吸附色谱中的氧化铝分为中性、酸性和碱性氧化铝,中性氧化铝水提取液的pH值为7.5,适用于醛、酮、醌、某些苷及酸碱溶液中不稳定化合物,如酯、内酯等化合物的分离,因此应用十分广泛。大多数情况下使用的是碱性氧化铝水提取液的pH值为9～10,常应用于碳氢化合物的分离,能中碳氢化合物中除去含氧化合物,还能对某些色素,甾族化合物、生物碱、醇以及其他中性、碱性物质的分离。酸性氧化铝水提取液的pH值为4～4.5,适用于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分离。

1.3 氧化锆

氧化锆和硅胶一样，具有优异的机械强度，适宜的孔结构和可用于键合其他功能基团的活性位点外，还具有更宽的pH耐受范围和更好的耐温性。氧化锆多孔小球可耐受pH0～14的环境，可高达900℃的温度下长时间工作不会变形且结构不遭受破坏。碳十八键合二氧化锆（ODZ）可在pH2～12范围内使用。聚丁二烯包覆二氧化锆复合填料在全pH值范围内稳定，并且能耐200℃的柱温。王晖等制备强离子（HO3S-PS-ZrO2）和强阴离子新型固定相[(Me)3N+-PS-ZrO2]，并尝试性地用于糖、核苷、核苷酸和脱氧核苷酸的分离。

1.4 复合型填料