荧光和化学发光的基本知识

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荧光信号
荧光强度的定量取决于这些参数：吸光度，光径 和稀释浓度，染料的荧光量子的产量，激发光源强度 和仪器荧光采集效率。在稀释溶液或悬液中，荧光强 度与这些参数成线性比例关系。
化学发光
化学发光的原理
某些荧光物质（例如Luminol, C8H7N3O2）可將化学反应中产生的能 量，转化成使分子內的电子由基态（ground state）跃升到激发态（excited state），处于激发态的分子并不穩定，將能量以光的形式释放出來；有的 光波长为可见光范围，但占多数的是荧光（fluorescence）。
① 激发
外源的白炽灯或激光提供的能 量（hvEX）的光子被荧光体吸收， 产生被激发的电子单峰态（S1’ ）。 这个过程是荧光和化学发光的区 别，化学发光的激发态是由化学反 应产生的。
② 激发态的寿命期
激发态存在一个有限的时间 （通常是1-10x10-9秒）。在这时 间，荧光体经历构象的改变和容易 受到分子环境的相互作用的影响。 这些过程有两个重要的结果。第 一， S1’的能量部分被消耗，形成一 个衰减的单峰激发态（ S1 ）即荧光 发射的初始。第二，不是最初被激 发的所有分子都通过荧光发射回到 基态。其他的过程，象振动淬灭， 荧光能量传递也在S1’衰减。荧光量 子的产生量，取决于激发的荧光光 子数量与吸收的光子数量的比率， 是衡量荧光效率的参数。
三、荧光的性质
• • • • • • 吸收光 保持固有的荧光特性 荧光波长＞激发波长（STOKES 法则） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓 度、荧光效率
四、荧光的产生与分子结构的关系
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（ϕ）：
五、影响荧光强度的因素
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺 酸中的重铬酸钾； 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端 重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
¾发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录
的样品发射荧光的强度。
¾激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的
激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。
荧光光谱
荧光寿命
¾定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一
定程度时所用的时间。
¾各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光淬灭
定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱 甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高 （≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等 。
几种常用的发光底物及增强剂
Luminol（～430nm） CSPD 发光最强最持久： CDP-Star（ ～460nm，蓝光） Sapphire-II™ 发光增强剂 Emerald-II™发光增强剂
注： 一般的试剂盒中已将发 光底物与发光增强剂预 先混合为发光底物
Luminol
发射的光量子数 ϕ= 吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的 速率常数有关。
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：π* → π的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
荧光和化学发光的基本知识
光的基本知识
按光谱分类： 狭义：可见光（400-700nm） 广义：紫外光（ 10-400nm） 可见光（400-700nm） 红外光（700-40000nm）
发光物质
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 炽热光或白炽光(incandescence)-因热而发光 气体激发(gas excitation>-因电子或热的激发而发光 摩擦发光(triboluminescence) 电激發光(electroluminescence) 荧光(fluorescence)-因光激发而发光，但光源切断后即不再发 光 磷光(phosphorescence)-因光激发而发光，但光源切断后仍会 持续发光 化学发光(chemiluminescence>-非生物体把多余的化学能转变 为光能 生物发光(bioluminescence)-生物体利用化学能发光
化学发光检测方法
1.X光片压片（传统方法） 但曝光时间需要摸索，压片法有一定不便，定量也不准 2.扫描仪 一定波长范围扫描 3.成像仪 Cooled CCD 4.荧光化学发光酶标仪
化学发光在生物学检测中的应用
杂交检测中的信号物质（非放射性标记）： 1. 2. 3. 4. 核酸杂交（Southern&Northern Blot） 蛋白印迹（Western Blot） 酶联免疫（Elisa） 其他： dot/slot杂交、原位杂交、 噬菌体文库筛选、菌落文库（质粒文库）筛选…
四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm
四甲基异硫氰酸罗丹 明 (TRITC) 藻红蛋白（PE） 7-氨基-4-甲基香豆素 Eu3+螯合物
550nm 490-560nm 354nm 340nm
620nm（橙红色） 595nm（红色） 430nm（蓝色） 613nm
七、荧光检测
荧光检测仪器 荧光检测系统的4个基本要素是：⑴激发光源，⑵荧光体，⑶将激发光 子与发射光子分离的特定波长的滤光片，⑷检测器记录发射光子并输出， 通常是电子信号或图像。 3种主要的荧光检测仪器提供不同的数据。 荧光分光光度计：测定液体样品（uL-mL） 荧光显微镜：解析荧光作为二维或三维空间位置定位功能 流式细胞仪：测定流体中每个细胞的荧光，在大量样品中进行分选并识别 和定量 激光扫描仪
5.溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。
六、荧光物质
荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。
常用的荧光物质
荧光物质 异硫氰酸荧光素 (FITC) 最大吸收光谱 490～495nm 最大发射光谱 应用 520～530nm （黄绿色） FAT、荧光偏振免疫测定 595～600nm（橙红色） FITC的衬比染色或双标 记FAT FITC的衬比染色或双标 记FAT 双标记FAT、流式细胞术 双标记或多标记FAT 时间分辨荧光免疫测定
什么是荧光？
荧光物质吸收激发光的能量后，电 子从基态跃迁到激发态，当其回复至基 态时，以发射光形式释放出能量，称为 荧光。
一、荧光发生过程
荧光产生于某些分子（通常是含多聚芳香烃的碳 水化合物或杂环化合物）称为荧光体或荧光染料。 荧光探针是一个荧光体设计用于定位生物样品的 特异性区域或对特异性刺激因子发生反应。 荧光发生是一个3阶段的过程。
③ 荧光发射
能量（hvEM）光子被激发，荧 光体回到基态S0。由于能量在激发 态寿命期的部分消耗，这些光子的 能量较低，因此比激发光子hvEX有 更长的波长。这种由于（hvEM - hvEX） 呈现的能量或波长的差异称作 Stokes漂移。Stokes 漂移奠定了荧光 技术灵敏性的基础，因为它可以与 激发光子在光谱上分离，而在一个 较低的背景下检测发射光子。相比 较而言，吸收光分光测定法在透射 光检测时相对于较高水平的同一波 长的光。
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发光
Excitation
F
Emission
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：传递
Excitation
Transfer
F1
F2
Emission
荧光分子受到激发后释放能量的3种方式：发热
Excitation
Transfer
F
BH
二、荧光发射光谱和激发光谱