褐藻胶裂解菌株筛选及优化
重组褐藻胶裂解酶酶解工艺的优化及产物分析
重组褐藻胶裂解酶酶解工艺的优化及产物分析王新侠;乔超超;倪辉;肖安风;蔡慧农;朱艳冰【摘要】为探索假交替单胞菌（ Pseudomonas syringae）重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的动态过程变化，采用DNS法和苯酚－硫酸法分别测定体系还原糖和总糖，根据二者比例，得出酶解产物随时间变化的平均聚合度，从而研究各因素对褐藻胶降解过程的影响，确定褐藻胶酶解工艺条件。
结果表明，重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的适宜工艺条件为：水解温度25℃， pH 7�5，初始底物质量浓度7 g ／L，加酶量0�48 U，静置条件下酶解反应210 min。
在此工艺条件下，产生的还原糖的质量浓度达0�878 g／L，平均聚合度为3。
酶解终产物的质谱鉴定结果显示为单糖、二糖和四糖。
%The aim of the study is to determine the dynamic process and technical conditions of alginate degradation by the recombinant alginate lyase from Pseudomonas syringae. The contents of the reducing sugar and the total polysaccharide were determined by 3 , 5-dinitrosalicylic acid assay and phenol-sulfuric acid method, respectively. According to the ratio of reducing sugar and total sugar, the variation regularity of av⁃erage polymeric degree of the enzymatic hydrolysates were obtained. The influence factors in the enzymatic process were studied, and the optimal conditions for alginate degradation by the recombinant alginate lyase were determined. The results showed that optimalco nditions for enzymatic hydrolysis were: temperature 25 ℃, pH 7�5, initial substrate concentration 7 g/L, enzyme 0�48 U, and reaction time 210 min. Under these condition, the concentration of reducing sugar reached 0�878 g/L and the average polymetric degree fell to 3 .The enzymatic hydrolysates were identified by mass spectrometer and the final products mainly included monosaccharide, disaccharide and tetrasaccharide.【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(021)005【总页数】7页(P338-344)【关键词】褐藻胶;酶解;工艺优化;褐藻胶寡糖;聚合度【作者】王新侠;乔超超;倪辉;肖安风;蔡慧农;朱艳冰【作者单位】集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】S188我国海藻资源丰富。
高效产褐藻胶裂解酶菌株产酶条件优化及降解寡糖结构分析
第２期
国晶晶ꎬ等: 高效产褐藻胶裂解酶菌株产酶条件优化及降解寡糖结构分析
２５３
通过对菌株形态、 生理生化鉴定及 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因 鉴定ꎬ 并优化其产酶条件ꎬ 进行发酵罐中试发酵ꎬ 利用菌株产粗酶液制备褐藻胶低聚糖或寡糖ꎬ 并对 降解的低聚糖或寡糖进行结构分析ꎬ 以期找到高效 产褐藻胶裂解酶的微生物菌株ꎬ 为后续褐藻胶寡糖 的分离纯化和生理活性研究提供数据资料ꎮ
第 ３４ 卷第 ２ 期 ２０ １ ９ 年 ４ 月
大连海洋大学学报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＤＡＬＩＡＮ ＯＣＥＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
Ｖｏｌ.３４ Ｎｏ.２ Ａｐｒ . ２ ０ １ ９
ＤＯＩ:１０.１６５３５ / ｊ.ｃｎｋｉ.ｄｌｈｙｘｂ.２０１９.０２.０１５
文章编号:２０９５ － １３８８( ２０１９) ０２ － ０２５２ － ０８
收稿日期: ２０１８－０６－０９ 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (３１４７１６１０) ꎻ 国家重点研发计划 (２０１８ＹＦＤ０９０１１０４) ꎻ 现代农业产业技术体系专项 ( ＣＡＲＳ－５０) 作者简介: 国晶晶 (１９９３—) ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎮ Ｅ－ｍａｉｌ: ４７８７７１１８７＠ ｑｑ������ ｃｏｍ 通信作者: 汪秋宽 (１９６２—) ꎬ 女ꎬ 教授ꎮ Ｅ－ｍａｉｌ: ｗｑｋ３２０＠ ｄｌｏｕ������ ｅｄｕ������ ｃｎ
海星 Ａｓｔｅｒｏｉｄｅａ ｓｐ������ 作为海洋无脊 椎 动 物ꎬ 隶 属于棘皮动物门ꎬ 主要食用海参、 牡蛎等以海藻等 作为主要食物的海洋动物ꎬ 其体内可以存在与消化 酶共同参与褐藻胶消化及吸收的微生物菌群ꎮ 目 前ꎬ 从海星内脏中筛选得到产褐藻胶裂解酶的菌株 鲜有报道ꎮ 本研究中ꎬ 主要以褐藻胶作为唯一碳 源ꎬ 在海星内脏中筛选出一株产褐藻胶裂解酶菌株ꎬ
动物组织检测褐藻胶裂解酶方法
动物组织检测褐藻胶裂解酶方法说到褐藻胶裂解酶，很多人可能会一脸懵，心想：这是什么神奇的东西，听起来好像是从外星球来的。
不过，说白了，褐藻胶裂解酶其实就是大自然的一个小秘密，它能把某些大分子物质“打碎”，让它们变得更小、更易于利用。
它的主要作用是分解褐藻中的褐藻胶，这种物质广泛存在于海藻中，尤其是在一些海带、裙带菜这样的海藻里。
听起来是不是有点像科幻片里那种超能物质？但它的应用非常实际，尤其是在生物学和环境科学的领域，简直是“神器”啊！这项技术最早是为了帮助分解海藻中的复杂糖类物质，让它们更容易被微生物或其他生物体吸收。
想象一下，海洋中的这些海藻，长得又大又强壮，内部那些繁复的化学结构不容易被自然界里的其他生物消化。
如果我们能找到一种办法，把它们分解成简单的糖类，那多好！褐藻胶裂解酶就是这么一个“拆解专家”，它能把那些复杂的糖链分解成小块，供微生物和动物们使用。
有了这个酶，咱们就能更好地理解海藻中的化学成分，也可以更高效地利用这些资源。
比如，褐藻胶裂解酶被用在食品加工中，用来提高某些产品的口感和品质；也能用在医药领域，帮助提取海藻中的有效成分，甚至有研究发现，它对环境污染治理也有一定的作用。
嘿，说到这，你是不是开始觉得这东西不简单了？但是，话说回来，做这项实验也不是那么容易的。
你得知道怎么从动物组织里提取出这种酶。
普通的实验室操作已经不能满足要求了，需要更精细的技术手段。
通常，研究人员会从一些动物体内，特别是海洋动物或者某些能吃海藻的陆生动物体内，提取出含有这种酶的组织。
想象一下，得从这些动物的肠道或者消化系统里找出酶，那可不是件轻松的事，像找针一样！不过，科学家们常常有办法把这些复杂的步骤搞得井井有条，就像解锁一道难题，总能找到一条路。
提取出来的酶要经过一些特殊的处理，才能保证它的活性。
就像我们做饭一样，调味料少了不行，火候掌握不好也不行。
酶也是有“脾气”的，它们在特定的温度、酸碱度条件下才能发挥作用。
高效褐藻胶降解菌的筛选与产酶条件优化
1115北京市科技专项(Z161100005016034)资助收稿日期: 2016-05-12; 修回日期: 2016-05-31; 网络出版日期: 2017-10-24北京大学学报(自然科学版) 第53卷 第6期 2017年11月Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 53, No. 6 (Nov. 2017) doi: 10.13209/j.0479-8023.2017.122高效褐藻胶降解菌的筛选与产酶条件优化李婷婷1,2 陈倩2 石萍1 耿旭3,†1. 深圳市重金属污染控制与资源化重点实验室, 北京大学深圳研究生院环境与能源学院, 深圳 518055;2. 北京市新型污水深度处理工程技术研究中心, 北京大学环境工程系, 北京 100871;3. 中美食品安全联合研究中心, 西北农林科技大学, 杨凌 712100;† 通信作者, E-mail: sgeng@摘要 以海藻酸钠为唯一碳源, 从天然腐烂海带中筛选得到一株高效褐藻胶降解菌株53#, 经形态学观察和16S rRNA 鉴定, 确定为类芽孢杆菌Paenibacillus agaridevorans 。
采用正交试验方法, 以pH 、温度、NaCl 浓度和海藻酸钠初始浓度为影响因素, 对该菌株的产酶条件进行优化, 得到53#菌的最佳产酶条件: pH=8, 25℃, NaCl 浓度15 g/L, 海藻酸钠初始浓度15 g/L 。
在最佳产酶条件下, 褐藻胶裂解酶最大酶活可达390.53±17.32 U/mL 。
筛选得到的类芽孢杆菌Paenibacillus agaridevorans 53#具有易于培养、产酶速度快和酶活力高等优点, 能够实现褐藻胶的高效糖化, 在褐藻生产生物乙醇领域具有潜在利用价值。
关键词 褐藻胶降解; 褐藻胶裂解酶; 类芽孢杆菌; 生物乙醇 中图分类号 X172Screening of Alginate Degrading Bacteria and Optimizationof Its Enzyme-Producing ConditionsLI Tingting 1,2, CHEN Qian 2, SHI Ping 1, GENG Shu 3,†1. Shenzhen Key Laboratory for Heavy Metal Pollution Control and Reutilization, School of Environment and Energy, Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055;2. Beijing Engineering Research Center for Advanced Wastewater Treatment, Department of Environmental Engineering , Peking University, Beijing 100871;3. Sino-US Joint Food Safety Research Center, Northwest A&F University,Yangling 712100; † Corresponding author, E-mail: sgeng@Abstract 53#, a strain of efficient alginate degrading bacteria, is isolated from rotted kelp using sodium alginate as the only carbon resource. Strain 53# is identified as Paenibacillus agaridevorans based on physiological characteristics and 16S rRNA sequencing. The optimaltion yield condition of strain 53# is identified at pH=8, T =25ºC, NaCl 15 g/L, and sodium alginate 15 g/L by orthogonal experiment and analysis, and the highest enzyme activity is 390.53±17.32 U/mL. Strain 53# has the advantages such as being cultivated easily, producing enzyme fast and having high enzyme activity. It can achieve a high efficiency for saccharification of alginate and thus has potential value to be utilized in the production of bioethanol from brown algae. Key words alginate degradation; alginate lyase; Paenibacillus ; biofuel近年来, 海洋藻类以生长速度快, 光合作用效率高, 不含难降解木质素, 不与粮食作物争夺土地和淡水资源等优点成为第三代生物能源原料[1]。
海洋弧菌褐藻胶裂解酶的分离纯化及性质
ΙΣΣΝ 2
生物化学与生物物理学报
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海洋弧菌褐藻胶裂解酶的分离纯化及性质
宋 凯 于文功 3 韩 峰 韩文君 李京宝
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Ταβλε 3 Συβστρατε σπεχιφιχιτψ οφ αλγινατε λψασε φρο µ ς ιβριο σπ . ΘΨ101
≥∏ ≥∏
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利用自制的
和
对酶的底物特
异性进行初步研究 结果表明 ςιβριο σπ ± ≠ 产
生的褐藻胶裂解酶对两种底物具有相同的活性 表
为一个酶活
力单位 ∀
温度对酶活性的影响 酶液分别在 ε !
ε ! ε ! ε ! ε ! ε ! ε ! ε 下保温
迅速冷却至 ε 紫外吸收法测定酶活性 同
时 分别测定酶液在不同温度下的活性 以确定酶
反应的最适温度 ∀
对酶活性的影响 缓冲液体系为
° 2柠 檬 酸
∗
°2
°
∗
× 2≤
∗
甘氨酸2
∗
∀酶分
别溶于上述缓冲液中 ε 保温
Ταβλε 1 Α συ µ µ αρψ οφ αλγινατε λψασε πυριφιχατιον (φρο µ 4 .0 Λ χυλτυρε)
× °∏
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ƒƒ
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一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用[发明专利]
![一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/ef64c41eec630b1c59eef8c75fbfc77da2699792.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.07.09C N 103911315A (21)申请号 201410008138.6(22)申请日 2014.01.03CGMCC NO8312 2013.10.09C12N 1/20(2006.01)C12N 9/88(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(71)申请人中国科学院天津工业生物技术研究所地址300308 天津市东丽区空港经济区中心大道西七道32号(72)发明人李德茂 陈树林 张藩 高峰(74)专利代理机构北京远大卓悦知识产权代理事务所(普通合伙) 11369代理人史霞(54)发明名称一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用(57)摘要本发明公开了一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8312，保藏日期为：2013年10月9日，所述菌株分类命名为：海洋嗜盐单胞菌SH-19(Halomonas elongata)，所述菌株的16SrDNA 的多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列。
本发明所述菌株SH-19可高效表达褐藻胶裂解酶，可应用于高效生产褐藻胶裂解酶，本发明所述菌株SH-19的发酵培养基配料简单，都是实验室中非常普遍容易获得的，发酵效果显著，使褐藻胶裂解酶的生产成本大大降低，可应用于大规模生产。
(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图3页(10)申请公布号CN 103911315 A1/1页1.一株产褐藻胶裂解酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8312，保藏日期为：2013年10月9日，所述菌株分类命名为：海洋嗜盐单胞菌SH-19(Halomonas elongata)。
提高褐藻胶裂解酶效果的方法
提高褐藻胶裂解酶效果的方法引言：褐藻胶裂解酶是一种重要的酶类，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。
为了提高褐藻胶裂解酶的效果，我们需要采取一系列措施来优化酶的活性和稳定性。
本文将介绍几种常用的方法，以提高褐藻胶裂解酶的效果。
一、优选酶源褐藻胶裂解酶可以从不同种类的褐藻中提取得到，不同种类的褐藻胶裂解酶具有不同的特性和活性。
因此，在选择酶源时，应根据实际需求选择合适的褐藻种类。
同时，还可以通过基因工程技术改造酶源，提高酶的活性和稳定性。
二、优化裂解条件裂解条件对褐藻胶裂解酶的效果有着重要影响。
常见的裂解条件包括温度、pH值、酶浓度、反应时间等。
通过调节这些条件，可以提高褐藻胶裂解酶的效果。
例如，适宜的温度和pH值可以增强酶的活性，合理的酶浓度和反应时间可以提高酶的裂解效果。
三、添加辅助剂在褐藻胶裂解酶的裂解过程中，添加适量的辅助剂可以提高酶的效果。
常用的辅助剂包括金属离子、有机溶剂、表面活性剂等。
金属离子可以作为酶的辅助因子，增强酶的催化活性；有机溶剂可以改变酶的构象，提高酶的活性和稳定性；表面活性剂可以增加褐藻胶的溶解度，促进酶的裂解作用。
四、应用联合酶法联合酶法是指将不同种类的酶一起应用于褐藻胶的裂解过程中。
通过联合酶法，可以充分利用不同酶的特性，提高褐藻胶的裂解效果。
例如，将褐藻胶裂解酶与纤维素酶联合使用，可以增强酶的裂解能力，提高褐藻胶的裂解率。
五、基因工程改造酶基因工程技术可以用于改造褐藻胶裂解酶，提高酶的活性和稳定性。
通过对酶基因进行改造，可以增强酶的催化活性、提高酶的热稳定性等。
例如，可以通过点突变、插入等手段改变酶的氨基酸序列，从而改善酶的性能。
六、应用生物反应器生物反应器是一种用于控制和优化生物过程的设备。
在褐藻胶裂解酶的生产过程中，应用生物反应器可以提供良好的生长环境和裂解条件，从而提高酶的效果。
生物反应器的设计和操作要合理，以充分发挥酶的活性和稳定性。
结论：通过优选酶源、优化裂解条件、添加辅助剂、应用联合酶法、基因工程改造酶和应用生物反应器等方法，可以有效提高褐藻胶裂解酶的效果。
乳糖诱导大肠杆菌产褐藻胶裂解酶的条件优化
ｒ ｅ ｉ ｆ ｎ ｉ ｎ ｇ ｃ ｒ ｕ ｄ ｅ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｗｉ ｔ ｈ Ｎｉ —Ｎ Ｔ Ａ ａ ｆ ｉ ｆ ｎ ｉ ｔ ｙ ｃ ｏ ｌ ｕ ｍｎ ． Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍａ ｌ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗ ａ ｓ ａ ｄ ｄ ｉ ｎ ｇ ２ ２ ｍｍｏ １ ／ Ｌ
２ ９℃ ， 诱导 ２ ２ ｈ ， 酶活可达到 ８ ． ５ ５ ２ Ｕ ／ ｍＬ 。 说 明 乳糖 可 以 作 为基 因 工程 菌的 高效 诱 导 剂 。
关键 词 ： 重组大肠杆菌 ， 褐 藻胶 裂 解 酶 ， 乳糖 ， 优 化
Ｅｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ ｏ ｐｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ａ ｌ ｇ ｉ ｎａ ｔ ｅ ｌ ｙ ａ ｓ ｅ ｉ ｎ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎａ ｎ ｔ Ｅｓ ｃ ｈｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ｉ ｎ ｄ ｕｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｌ ａ ｃ ｔ ｏ ｓ ｅ
摘 要： 本文研 究 了使用乳糖 替代 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ（ 异丙基硫代半乳糖苷 ） 诱导褐 藻胶 裂解酶在 重组大肠杆 菌 中表达 的可行性 ，
通过 摇 瓶 实验 ， 分 别 对诱 导终 浓度 、 诱导温度、 诱导时机、 诱 导 时 间等 方 面进 行 了单 因 素 实验 并 利 用 响 应 面 对 条 件 进 行 了优 化 设 计 ， 并使 用 Ｎ ｉ － Ｎ Ｔ Ａ 亲 和 柱 对 粗 酶 液进 行 了 纯化 得 到 纯 酶 。 结 果 表 明 ， 诱 导 乳 糖 终 浓度 ２ ２ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ， 诱 导 温度
ｉ ｎｄ ｕｃ ｔ ｉ ｏ ｎ． ｔ ｈ ｅ ｄｕ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｅ ｒ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｄ． Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｓ ｅ ｓ ｕｒ ｆ ａ ｃ ｅ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｉ ｍｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｔ ｈｅ ｄ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｎ ｄ ｔ ｏ ｆ ａ ｂ ｒ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｐ ｕｒ ｅ ｅ ｎｚ ｙ ｍｅ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｉ ｎ ｄ ｕ ｓ ｔ ｒ ｙ
产褐藻胶裂解酶芽胞杆菌的筛选、鉴定及其降解效果评价
产褐藻胶裂解酶芽胞杆菌的筛选、鉴定及其降解效果评价黄惠琴;宋鑫;刘敏;胡永华;鲍时翔【摘要】褐藻胶是广泛存在于褐藻中的一类多糖, 降解为褐藻寡糖后能表现出更多的生物活性.从海洋样品中筛选出产褐藻胶裂解酶芽胞细菌16株, 基于形态、生理生化特征和16S r DNA系统发育分析初步鉴定菌株HB12274为解淀粉芽胞杆菌植物亚种 (Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum) .TLC结果显示, 海藻酸钠经粗酶液降解形成2～7聚合度的褐藻寡糖和单糖, 菌株与马尾藻叶片共培养时能明显降解叶状体结构.为褐藻胶裂解酶的生产和工业应用提供了新的菌株来源.%Algin is a kind of polysaccharide widely existing in brown algae, and after degraded into algin oligosaccharide, it shows more bio-activities.In this study, a total of 16 algin lyase-producing Bacillus strains were screened from marine samples.Based on morphology, physiological and biochemical properties, and 16S r DNA sequencing and phylogenetic analysis it is characterized that strain HB12274 was Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum.The polymerization degree of the main product-algin oligosaccharide degraded by the crude enzyme was between 2-7 and monosaccharide.When leaves of Sargassum cultured with the strain the thalamus structure could be obviously degraded.This study provides a new strain resource for the production and industrial application of algin lyase.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2018(038)006【总页数】5页(P54-58)【关键词】褐藻胶裂解酶;筛选;鉴定;芽胞杆菌;酶活【作者】黄惠琴;宋鑫;刘敏;胡永华;鲍时翔【作者单位】中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南海口 571101;海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室, 海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南海口 571101;海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室, 海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南海口 571101;海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室, 海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南海口 571101;海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室, 海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南海口 571101;海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室, 海南海口 571101【正文语种】中文【中图分类】Q93-331褐藻胶是一种极具应用价值的多糖类物质，广泛存在于褐藻纲的藻类植物中，是细胞壁的重要组成成分，也部分存在于细胞质和细胞间质中[1]。
海藻酸钠降解菌株的筛选
实验方法
4.pH 在发酵培养基中，分别按6.0、6.4、6.8、 7.2、7.6调节培养基的pH，接其他物质含量 不变。
5.蛋白胨浓度
在发酵培养基中分别添加浓度为0.1%、0.3%、 0.5%和0.7%的蛋白胨，接其他物质含量不变。
实验结果---菌株筛选
本实验初筛后分离得到10多株能够产海藻胶裂解酶的 细菌，通过比较菌落周围透明圈与菌落的直径比值以 及透明圈的透明度，选择菌株11为后期的实验菌。
海藻酸钠降解菌株的筛选
指导教师：姚子昂 教授 答辩人：许媛丽
答辩内容
研究背景 选题依据和意义 实验材料 实验方法 分析讨论 致谢
研究背景
海藻酸钠 ---又名褐藻酸
钠、褐藻胶，是一种来 源于海洋褐藻的阴离子 酸性多糖 ，是海带中提 取的由α-L-1 , 4古罗糖 醛酸(G)及β-D-1, 4甘露 糖醛酸(M)随机组合形成 的线性高分子量聚合物， 广泛应用于食品、医药 等方面。
致谢
本论文是在姚子昂老师和吴海歌老师的悉心指 导下完成的。他们以敏锐的学术思想、从课题 的选题、实验设计到论文撰写过程都给予正确 的引导和帮助。感谢高凤山老师对我论文的评 阅。在论文完成过程中，我得到了张玉娟、何 宇、高征等师兄师姐的帮助和指导，在此对他 们表达真挚的感谢。
最后，感谢四年的大学生活，感谢学院所有老 师四年来对于我的关心和爱护。
实验结果---生长曲线和酶活曲线
由图可以看出，菌株11在3 h后开始进入对数生长期， 并于30 h达到最大生物量。随后，随培养时间延长， 该菌很快开始衰亡。
实验结果---生长曲线和酶活曲线
由图4可以看出，菌株11的酶活曲线在开时3h后呈增 长趋势，并在27h达到最大活性，随后，随培养时间 延长，酶的活力开始降低。
具有海带褐藻胶降解能力的刺参有益菌筛选及降解条件优化
具有海带褐藻胶降解能力的刺参有益菌筛选及降解条件优化王熙涛;徐永平;金礼吉;李淑英;尤建嵩;汪将;李建光;张美霞;宋亚雄【摘要】In Apostichopus japonicas (sea cucumber)farming,Laminaria japonica used as feed was viscoelastic and stodgy because of lower specific enzyme activities to large amounts of align.In this study ,an algin-degrading bacteria W16 was isolated and purified from sea mud using the medium with the sodium alginate as the sole carbon source.16S rDNA dentification and phylogenetic analysis showed that the strain was identified as Bacillus flexus.Toxicity experiment showed that strain W16 had no pathogenicity to the sea cucumber.The study focused on seven factors affecting growth and algin-degrading capacity of strain.The optimum fermentation conditions of growth and algin-degrading capacity of strain were de-termined through single-factor and orthogonaltest:fermentation time 96 h,alginate 0.2%,initial pH 7.5,fermentation tem-perature 30℃,(NH4)2SO4 0.3%,NaCl 2.5%,liquid medium volume 40mL(200 mL flask,ratio of solid to liquid=1∶30).Un-der these conditions,the algin-degrading capacity of strain W16 was increased by 3.29 times relative to before.%为研究刺参养殖中海带饲料原料存在的高黏度、低消化率等问题，本试验以褐藻酸钠为唯一碳源的选择性培养基从海泥中筛选出一株能降解海带中褐藻胶且对刺参无致病性的细菌。
褐藻胶裂解酶及其裂解产物的研究进展
食品研究与开发２００６．Ｖｏｌ．２７．ＮＯ．１１褐藻胶是褐藻酸盐、褐藻酸及其衍生物的统称，是从海带、马尾藻、巨藻等褐藻间质中提取的多糖聚合物。
主要由１，４－β－Ｄ－甘露糖醛酸（Ｍ）及其Ｃ５差向异构体１，４－α－Ｌ－古罗糖醛酸（Ｇ）两种糖醛酸单体聚合而成。
聚合方式有四种：可以由多聚β－Ｄ－甘露糖醛酸（ＰｌｏｙＭ）或多聚α－Ｌ－古罗糖醛酸（ＰｌｏｙＧ）构成均聚物，也可以由ＭＧ交替（ＰｏｌｙＭＧ）或Ｍ、Ｇ以不同比例随机构成杂聚物［１］。
近年来，褐藻胶的开发利用引起了人们广泛重视，对褐藻胶裂解酶及其降解产物的研究成为热点。
本文就这两方面作较为详细的总结与阐述。
１褐藻胶裂解酶１．１来源褐藻胶裂解酶主要有三个来源：第一类是动物源的褐藻胶裂解酶，包括海洋软体动物和棘皮动物等。
１９８４年，国内的朱仁华等［２］从朝鲜花冠小月螺、单齿螺和褐疣荔枝螺３种海螺中分离得到褐藻胶裂解酶的粗酶提取液，用粘度法测定了酶活力，尤以朝鲜花冠小月螺的分解活性最高。
１９８７年，Ｋｌｏａｒｅｇ等［３］从海兔内脏中制备出褐藻酸酶，用于墨角藻合子的去壁，制备出了原生质体。
１９８９年，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等［３］从海螺、鲍的内脏中制备出褐藻解壁酶，用于某些褐藻的细胞解离。
第二类是植物源的褐藻胶裂解酶，包括巨藻、泡叶藻、掌状海带、克氏海带等海藻。
１９６６年，ＬｉｎＹ．Ｔ．等［４］从海洋褐藻ＦｕｃｕｓｇａｒｄｎｅｒｉＳｉｌｖａ中分离提纯出褐藻酸酶。
１９９９年，Ｋｒａｉｗａｔｔａｎａｐｏｎｇ等［５］自腐败海藻ｋｏｍｂｕ中分离出一株褐藻胶酶高产菌Ｎ－１，并对其降解酶基因进行了克隆和测序。
第三类是微生物源的褐藻胶裂解酶，包括海洋细菌、土壤细菌和真菌等。
１９８４年，Ｊｅｆｆｒｅｙ等［６］以褐藻酸钠为惟一碳源，从土壤和海水中分离出产生褐藻酸裂解酶的芽孢杆菌，胞外酶表现出明显的内切甘露糖醛酸裂解酶性质，酶的分子量约为４０ｋＤ。
２００１年，Ｉ－ｗａｍｏｔｏ［７］等人研究发现埃氏别单胞菌（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓｓｐ．）可以产生一种褐藻酸胞内裂解酶，分子量为３３．９ｋＤ，ｐＩ为３．８，在ｐＨ７．５￣８．０时，具有最高活性。
褐藻胶裂解酶的基因克隆及表达条件优化
Ｇｕ ｌ ｆ Ｍａ ｒ ｉ ｎ ｅ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ｅ ， Ｎ ａ ｎ ｎ ｎｇ５ ｉ ３ ０ ０ ０ ７ ， Ｃ ｈ ｎａ ｉ ； ． Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ Ｖ ｏ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｎｄ ａ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ， Ｎ ａ ｎ ｎ ｉ ｎ ｇ５ ３ ０ ２ ２ ￣Ｃ ｈ ｎａ ｉ ）
１ ６ ｈ ， 诱 导剂 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 浓 度０ ． ８ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ 。
关键 词 ： 褐藻 胶裂 解 酶 ； 基因； 克隆 ； 条件 优化 ； 表 达
中图分 类号 ： Ｑ ８ １ ４
文 章编 号 ： ０ ２ ５ ４ — ５ ｏ ７ １ （ ２ ０ １ ７ ） １ ２ — ０ １ ２ ０ — ０ ６
摘 要： 采 用大 肠 杆菌 （ Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｄ 表 达海 洋 弧菌 （ Ｖ ｉ ｂ ｒ ｉ ｏ ｓ ｐ ． ） Ｘ ５ １ １ 的褐 藻 胶裂 解 酶基 因 ， 以 实现对 该 酶 的人 量制 备 及 酶学 性 质
研 究 。通 过序 列分 析 ， 预 测 该酶 的前２ ０ 个氨 基 酸为信 号肽 ， 去 除信 号肽 后 的蛋 白质 分子质 量约 为 ３ ０ ２ ５ ４ ． ２ ８ Ｄ ａ ， 等 电点８ ． ７ ５ ， 分 子式 为 Ｃ ， Ｈ ｏ ｏ Ｎ， ６ ４ ０ ， Ｓ ， 对应 的基 因序列 命 名为 ａ ｌ ｇ １ ９ ８ ７ 。 按 如 下方 案构 建蕈 组菌 ： 设计 特异 性核 酸 引物 ， Ｐ ｃ Ｒ 扩 增得 到ａ １ ９ ８ ７ ； 将重 组质 粒 ｐ Ｅ Ｔ 一 ３ ０ （ ａ ） 一 ａ ｌ ｇ １ ９ ８ ７ 导入 大肠 杆 菌 Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ５ ｃ ￣ 进行测序； 提取 阳性ｐ Ｅ Ｔ 一 ３ ０ （ ａ ） 一 ａ ｌ ｇ Ｊ ９ ８ ７ 质 粒 导入 大 肠杆 菌Ｂ Ｌ ２ １ ， 利 用 异丙 基一 Ｊ Ｂ 一 ／ ９ － 硫 代 半 乳 糖苷 （ Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ ） 诱 导表 达 。 十二烷 基硫 酸钠 聚 丙烯酰 胺 凝胶 电泳 （ Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ ） 检测 诱 导后 的重 组菌 胞液 上清 ， 发现 异源 表 达的 褐藻 胶裂 解 酶分 子质 量大 小 与预测 值 相近 。对 重组 菌 中的褐 藻 胶裂 解 酶进 行表 达条 件 优化 ， 结果 显示 ， 最 适参 数 为诱 导温 度 １ ６ ０ Ｃ ， 诱 导 时间
产褐藻胶裂解酶菌种的筛选、鉴定及发酵条件优化
褐藻胶裂解酶发酵工艺优化及其中试放大
褐藻胶裂解酶发酵工艺优化及其中试放大陈艳红;杨帆;肖安风;倪辉;朱艳冰;蔡慧农【摘要】Microbulbifer sp�ALW1 isolate was subjected to fermentation parameters optimization in a⁃ttempt to increase the alginate lyase producing ability in a 5 L bioreactor. The results showed that the additionof 1 g/L alginate was better for enzyme production than double or half the concentration, and 25 ℃ was more conductive to enzyme accumulation than 20 ℃. In addition, when pH was controlled at 7�5, the peak ofal⁃ginate lyase yield occurred earlier than that at natural pH, but the yields showed little change. Based on the optimized conditions, the fermentation processes for alginate lyase production were scaled up and the maxi⁃mum alginate lyase activities of 57�0 U/mL, 43�5 U/mL, and 38�3 U/mL were achieved in 20 L bioreactor, 200 L bioreactor and 500 L bioreactor respectively, which were 39�6%, 30�2% and 26�5% of the small scale level.%对产微球茎菌（ Microbulbifer sp．） ALW1发酵产褐藻胶裂解酶5 L罐发酵工艺进行优化，建立褐藻胶裂解酶的高产发酵工艺。
褐藻胶裂解酶高产菌株YSH5的筛选及酶学性质研究
褐藻胶裂解酶高产菌株YSH5的筛选及酶学性质研究目录一、内容描述 (2)1. 研究背景 (2)2. 研究目的与意义 (3)3. 研究内容与方法 (4)二、材料与方法 (5)1. 原料与试剂 (6)2. 实验室准备 (7)3. 菌株筛选与培养 (8)4. 酶活性测定 (9)5. 酶学性质研究 (10)三、结果与分析 (11)1. 菌株筛选结果 (13)初筛与复筛过程 (14)高产菌株的鉴定 (15)2. 酶活性的测定 (16)最适pH值与温度的确定 (17)不同底物对酶活性的影响 (17)3. 酶学性质的研究 (18)酶的稳定性分析 (20)酶的米氏常数测定 (20)酶促反应动力学研究 (21)四、讨论与结论 (22)1. 结果讨论 (23)菌株筛选方法的优化 (25)酶学性质的变异原因分析 (25)2. 结论与展望 (26)高产菌株YSH5的特性总结 (27)对未来研究的建议 (28)一、内容描述本论文研究了褐藻胶裂解酶高产菌株YSH5的筛选及其酶学性质。
通过一系列的筛选实验，从自然界中分离得到多株褐藻胶裂解酶产生菌，最终确定了一株酶活较高的菌株YSH5。
该菌株不仅具有较高的酶活，还具有稳定的遗传特性和良好的生产潜力。
在酶学性质方面，本研究对YSH5菌株产生的褐藻胶裂解酶进行了详细的酶学分析。
通过不同的条件优化，确定了该酶的最适反应温度和pH值，并探讨了金属离子、表面活性剂等对该酶活性的影响。
还对褐藻胶裂解酶的纯化、结构特征以及催化机制进行了初步的研究，为褐藻胶裂解酶的进一步研究和应用提供了重要的理论基础和实验依据。
1. 研究背景褐藻胶裂解酶是一种具有重要生物学功能的酶类，主要参与褐藻胶的降解过程。
褐藻胶是一种广泛存在于海洋和淡水中的高分子多糖，对环境具有重要的生态学意义。
由于褐藻胶在自然界中的存在形式多样，导致其降解过程受到多种因素的影响，限制了褐藻胶资源的有效利用。
研究褐藻胶裂解酶的高产菌株及其酶学性质具有重要的理论和实践意义。
褐藻胶裂解酶产生菌Vibro sp.OY102的发酵条件优化
褐 藻胶裂 解酶 ， 称为褐 藻 胶 酶 或褐 藻 胶 解 聚酶 ， 也 可通 过 Ｂ消 去 机 制 催 化 褐 藻胶 的 降 解 在 非 还 原 末 端 ． Ｃ ５间形 成 不 饱 双 键 。该 酶 根 据 作 用 底 物 的不 同 可 Ａ， 分 为 甘露糖 醛 酸裂 解 酶 （ Ｃ ． ． ． ） 古 罗糖 醛 酸 裂 Ｅ ４ ２２ ３ 和
褐藻胶裂解酶 产生菌 Ｖ ｂｏｓ ． ｉｒ ｐ ＱＹ１２ ０
的发酵条件 优化
傅晓 李 ， 峰， 枝， 功 妍， 京宝 韩 路新 于文
（ 中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室； 山东省海洋药物重点实验室； 中国海洋大学海洋药物与食品研究所。 山东 青岛 ２６０） ６０３
摘
要 ： 对海 洋来源 的 Ｖｂｏｓ ． １ ２的产褐藻胶裂解酶 的发 酵条件进行研究 。结果表 明， ｉ ｐ ＱＹ ０ ｒ 该菌株最适液 体培养基 成分
０． １％ Ｍ ｇ Ｏ４ ７ ０ ； ０ ％ Ｆ Ｓ ‘ Ｈ２ ｐ ＝ ６ ０ ０ Ｓ ・ Ｈ２ ０． １ ｅ Ｏ４ ７ ０， Ｈ ．，
１０ Ｐ 灭 菌 １ ｎ ０ｋ ａ ５ｍｉ。种 子 培 养 基 与 发 酵 培 养 基 成 分 相同， 固体培 养基 中加 入 １５ ｗ／ ） 脂 粉 。 ． ％（ ｖ琼 １４培 养条 件优 化 ．
为（ ／ ）０ ５ 褐 藻酸钠 ；． ％ 蛋 白胨 ； ． ％ Ｋ ２ Ｏ４０ ７ Ｋ ＨＰ ４ ３ ０； ％ Ｎ Ｃ ； ． １ Ｍｇ Ｏ ‘ Ｈ Ｏ ｐ ｗ ｖ ：． ％ ０４ ０３ Ｈ Ｐ ； ． ％ ２ ０ ・Ｈ２ ２ ａ １０ ０ ％ Ｓ ４ ７ ２ ， Ｈ＝６０ ．。
褐藻酸降解菌株S3的筛选分离及培养条件和产酶能力
Ｎｎｎｎ （ ｏｔｅ ｔ ｃｌ ｒｌ ｎｖｒｔ， ｒｉ １０ ３ ， ．Ｒ．Ｃ ｉａ ／ Ｊｕ ｌ ｆ ｏ ｈａｔ ｏｅｔ ｎｖｒｔ． ｉｇ ｉ Ｎ ｒ ａ ｇ ｈ ｓ Ａ ｕｔ ａ Ｕ ｉ ｓｙ Ｈａ ｎ ５０ ０ Ｐ ｕ ｅｉ ｂ ｈｎ ）／ ｏｍａ ｏ ｒ ｅ ｒｓｙＵ ｉ ｓ ｙ 一 Ｎ ｔｓ Ｆ ｒ ｅｉ
ｐ ｒｅ ｔ ｎ ． ｅｃｎ ）ａ ｄ０ １ｍｍｏ／ ｆｌｎｈ ｎ ｍ ｉ ａｅｈ ｓａｍｏ ｅａｅｅ ｃｅ ｃ １ ． ｅｃｎ ） ｌＬ ｏ ｔａ ｕ ｎｔ ｔ ａ ｄ ｒｔ ｆ ｉｎ ｙ（ ６ ６ｐ ｒｅ ｔ ． ａ ｒ ｉ
值 ７ ５条 件 下 ， 酵 ｓ ． 发 ３茵株 １ ， 藻 酸 酶 酶 活 最 高。 继 而 研 究 了稀 土 元 素 对 海 洋微 生 物 的 生 长及 产 酶 能 力 影 ８ｈ 褐 响， 发现 某些低浓度的稀土元素对 菌株 ｓ 酶有一 定的促进作 用， 中０ １ ｏ Ｌ硝酸铈促进作用最 强， ７产 其 ． ｌ ｍｍ ／ 促进 率 约 ３ ．％ ， １ １ 男外０ １ ｍ ｌＬ硝酸镧对 菌株 Ｓ ． ｏ／ ｍ ３产酶 能力的促进率也达到 １ ．％ ， 高浓度的稀土元素均有强抑制 ６６ 而 作用。研究结果为海洋微 生物褐藻酸酶的进 一步开发利 用打 下基础 。 关键词 菌株 Ｓ ； 藻酸酶 ； ３褐 稀土元素 分类号 Ｑ ３３ ９ ．
ｔ ｅ ｓ ａｎ Ｗ ｕ ｔｒ ｄ ｉ ｅ ｍｅ ｉ ｍ ｎ ｅ ｅ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓｏ ２ ｄ ｇ ｅ ｓＣ，Ｎａ １ ｏ ｔｎ ｆ ｅ ｃ ｎ ．ｐ ７ ５ ｆ ｒ１ ． ｈ ｔ ｉ ａ ｃ ｕ ｅ ｎ ｔ ｄ ｕ ｕ ｄ ｒ ｈ ｏ ｄ ｔ ｎ ｆ ｅ ｒ ｅ ｒ ｓ ｌ ｈ ｔ ｉ ２ Ｃ ｎｅ ｔ ｐ ｒ ｅ ｔ Ｈ ． ｏ ８ｈ Ｕ ｃ ｏ２
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褐藻胶裂解菌株筛选及优化
褐藻胶是存在于褐藻中的一类褐藻多糖,利用食用褐藻的棘皮动物内脏筛选并优化菌株培养条件,使之产生高活性的褐藻胶裂解酶,在制备褐藻寡糖等方面具有重大应用价值。
本文以褐藻酸钠为唯一碳源,从皱纹盘鲍内脏中筛选分离得到12株产褐藻胶裂解酶菌株,检测12株菌的发酵液酶活并优选酶活最高的两株菌,分别命名为M3与M7,基于16S rDNA系统发育树分析,初步确定M3、M7菌株属于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)属。
本文采用Plackett-Burman试验、中心复合试验设计(Central Composite Design,CCD)对M3菌株进行发酵产酶优化。
根据M3菌株单因素试验的优化结果设计Plackett-Burman试验,结果表明影响酶活的4个显著影响因素为培养温度、初始pH、褐藻胶浓度和蛋白胨浓度,以此优化结果进行中心复合试验设计(Central Composite Design,CCD),应用响应面方法进行回归分析,结果表明其最佳产酶条件为:初始pH 7.5,接种量2%,褐藻胶浓度0.5%,装液量50 mL,蛋白胨浓度0.6%,培养温度为28℃,200 r/min,酶活最高可达到1.063 U/mL。
采用正交试验方法对M7菌株产酶条件进行优化,优选菌株培养基。
M7菌株通在单因素试验的基础上利用正交试验优化菌株的产酶条件,研究结果显示菌株的最佳产酶条件为:初始pH 7.5,接种量为6%,褐藻胶浓度1.0%,装液量为10 mL,氯化钠浓度为1%,培养温度为18℃,200 r/min,酶活最高终达到1.751 U/mL。