离子交换色谱ppt课件
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(二)交换剂装柱 (1)离子交换色谱柱的选用 (2)装柱
垂直装柱,严防气泡和断层。
14
当所用的交换剂与待分离物质各组分之间亲和力差 不多而需要交换剂体积较大时,以增加柱长为宜, 使待分离组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增 加。柱的直径与高度比以1:20左右为宜。
如采用离子强度较大的洗脱液梯度洗脱时,以选用 粗而短的柱子为宜,因为当柱上洗脱液的离子强度 高到足以完全取代被吸附离子时,这些被置换的离 子则以同洗脱液等速率向下移动,如果柱细长,就 增加了脱附离子扩散的机会。
3
2、平衡常数
离子交换反应和其他化学反应一样,完全服从质量作用定律,且 离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物所进行的离子交换反应 是可逆的。 阳离子交换剂RA,在溶液中解离出阳离子A+与溶液中的阳离子B+ 发生可逆交换反应:RA+B+ ⇋RB+A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力,离子交换剂的 选择性可用平衡常数K表示:
1、离子交换剂应具备高度的不溶性,保证在各种溶剂 中不会发生溶解; 2、具备稳定的理化性质,不能因物理化学变化而发生 分解; 3、具有较大的表面积或疏松的孔状结构,确保交换离 子自由地发生扩散和交换。
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离子交换剂
1、疏水性离子交换剂
与水亲和力较小的人工合成树脂 (1)阳离子交换剂 阳离子交换树脂具有酸性基团,电荷基团带负电,反离子带正电, 可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。 (2)阴离子交换剂 阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺[-NH2]、仲胺[-NHCH3]、 叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N+(CH3)3]基团后构成的。
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(三)样品上柱、洗脱和收集 (1)上柱 (2)洗脱 IEC中的洗脱是至关重要的一步,从交换剂上把被吸附 的物质洗脱下来,有两种方法:一种是增加离子强度, 置换出被吸附的离子;另一种是改变pH,使被吸附的 离子解离度降低,减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。 (3)收集 用部分收集器分部收集,收集体积一般为柱体积的 1%~2%。
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2、亲水性离子交换剂
基质为与水亲和力较大的天然或人工的化合物 (1)纤维素离子交换剂 以微晶纤维素为基质,再引入电荷基团构成,最为广泛使用的是 二乙氨基乙基(DEAE-)纤维素和羧甲基(CM-)纤维素。 (2)交联葡聚糖离子交换剂 以交联葡聚糖G-25和G-50为基质,通过化学方法引入电荷而制成 的。 (3)琼脂糖离子交换剂 以交联琼脂糖CL-6B为基质,引入电荷基团而构成。
离子交换色谱
Ion exchange chromatography,IEC
2020/41/29
内容
一、离子交换色谱的基本原理 二、离子交换剂的基本性质 三、离子交换介质的选择原则 四、离子交换色谱的基本操作
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一、基本原理
1、基本原理 以离子交换树脂等作为固定相,树脂上具有固定离子基 团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的 离子通过固定相时,组分离子与树脂上可交换的离子基 团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得 到分离。
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Thank you !
17
K [RB][ A] [ RA][ B]
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1
2
3
4
5
反离子
样品溶液
梯度溶液
图1阶段:样品与反离子进行交换
3,4-梯度缓冲液洗脱,先洗下弱吸附物质,再洗下强吸附物质
5-再生阶段:原始平衡缓冲液进行充分洗脱,即可重复使用 5
二、离子交换剂的基本性质
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三、离子交换剂的选择原则
1、离子交换剂的选择
(1)如果被分离物质带正电荷,则选用阳离子交换剂;如果带负 电荷,应选用阴离子交换剂。 (2)强型离子交换剂适用的pH范围很广,用来分离一些在极端pH 中解离且较稳定的物质;弱型则适宜用来分离生物大分子,活性不 易丧失。 (3)在分离生物大分子物质时,由于亲水性基质对被分离物质的 吸附和洗脱都比较温和,生物活性不易破坏而常被选用。 (4)交换容量:通常选用离子交换剂与溶液中离子或离子化合物 进行交换能力较大的介质。 (5)交换速度:一般选用交换速度快的介质。
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(2)在离子交换剂的交换容量固定的情况下,起始缓 冲液的浓度应尽可能的低 (3)缓冲液离子不影响被分离蛋白或干扰其活性,同 时不应影响目标蛋白的溶解度。
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四、离子交换色谱的基本操作
图3 IEC装置示意图
13
(一)交换剂的预处理、再生 (1)用水浸透使干树脂吸水溶胀,再用酸、碱 处理除去水中的不溶性杂质。 (2)再生是指将用过的离子交换剂恢复原状的 处理过程。
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2、缓冲液的选择
(1)对于两性蛋白质 来说,缓冲液的pH决定 蛋白质在该缓冲体系下 所带的电荷, 以一个pI为5的蛋白为 例:
+
等电点
蛋
白
吸附阴离子交换剂
质
净
pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
电
荷 吸附阳离子交换剂
图2 蛋白质静电荷与pH的关系
pH < pI(+) pH = pI(0) pH > pI(-)
垂直装柱,严防气泡和断层。
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当所用的交换剂与待分离物质各组分之间亲和力差 不多而需要交换剂体积较大时,以增加柱长为宜, 使待分离组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增 加。柱的直径与高度比以1:20左右为宜。
如采用离子强度较大的洗脱液梯度洗脱时,以选用 粗而短的柱子为宜,因为当柱上洗脱液的离子强度 高到足以完全取代被吸附离子时,这些被置换的离 子则以同洗脱液等速率向下移动,如果柱细长,就 增加了脱附离子扩散的机会。
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2、平衡常数
离子交换反应和其他化学反应一样,完全服从质量作用定律,且 离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物所进行的离子交换反应 是可逆的。 阳离子交换剂RA,在溶液中解离出阳离子A+与溶液中的阳离子B+ 发生可逆交换反应:RA+B+ ⇋RB+A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力,离子交换剂的 选择性可用平衡常数K表示:
1、离子交换剂应具备高度的不溶性,保证在各种溶剂 中不会发生溶解; 2、具备稳定的理化性质,不能因物理化学变化而发生 分解; 3、具有较大的表面积或疏松的孔状结构,确保交换离 子自由地发生扩散和交换。
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离子交换剂
1、疏水性离子交换剂
与水亲和力较小的人工合成树脂 (1)阳离子交换剂 阳离子交换树脂具有酸性基团,电荷基团带负电,反离子带正电, 可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。 (2)阴离子交换剂 阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺[-NH2]、仲胺[-NHCH3]、 叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N+(CH3)3]基团后构成的。
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(三)样品上柱、洗脱和收集 (1)上柱 (2)洗脱 IEC中的洗脱是至关重要的一步,从交换剂上把被吸附 的物质洗脱下来,有两种方法:一种是增加离子强度, 置换出被吸附的离子;另一种是改变pH,使被吸附的 离子解离度降低,减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。 (3)收集 用部分收集器分部收集,收集体积一般为柱体积的 1%~2%。
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2、亲水性离子交换剂
基质为与水亲和力较大的天然或人工的化合物 (1)纤维素离子交换剂 以微晶纤维素为基质,再引入电荷基团构成,最为广泛使用的是 二乙氨基乙基(DEAE-)纤维素和羧甲基(CM-)纤维素。 (2)交联葡聚糖离子交换剂 以交联葡聚糖G-25和G-50为基质,通过化学方法引入电荷而制成 的。 (3)琼脂糖离子交换剂 以交联琼脂糖CL-6B为基质,引入电荷基团而构成。
离子交换色谱
Ion exchange chromatography,IEC
2020/41/29
内容
一、离子交换色谱的基本原理 二、离子交换剂的基本性质 三、离子交换介质的选择原则 四、离子交换色谱的基本操作
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一、基本原理
1、基本原理 以离子交换树脂等作为固定相,树脂上具有固定离子基 团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的 离子通过固定相时,组分离子与树脂上可交换的离子基 团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得 到分离。
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Thank you !
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K [RB][ A] [ RA][ B]
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反离子
样品溶液
梯度溶液
图1阶段:样品与反离子进行交换
3,4-梯度缓冲液洗脱,先洗下弱吸附物质,再洗下强吸附物质
5-再生阶段:原始平衡缓冲液进行充分洗脱,即可重复使用 5
二、离子交换剂的基本性质
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三、离子交换剂的选择原则
1、离子交换剂的选择
(1)如果被分离物质带正电荷,则选用阳离子交换剂;如果带负 电荷,应选用阴离子交换剂。 (2)强型离子交换剂适用的pH范围很广,用来分离一些在极端pH 中解离且较稳定的物质;弱型则适宜用来分离生物大分子,活性不 易丧失。 (3)在分离生物大分子物质时,由于亲水性基质对被分离物质的 吸附和洗脱都比较温和,生物活性不易破坏而常被选用。 (4)交换容量:通常选用离子交换剂与溶液中离子或离子化合物 进行交换能力较大的介质。 (5)交换速度:一般选用交换速度快的介质。
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(2)在离子交换剂的交换容量固定的情况下,起始缓 冲液的浓度应尽可能的低 (3)缓冲液离子不影响被分离蛋白或干扰其活性,同 时不应影响目标蛋白的溶解度。
12
四、离子交换色谱的基本操作
图3 IEC装置示意图
13
(一)交换剂的预处理、再生 (1)用水浸透使干树脂吸水溶胀,再用酸、碱 处理除去水中的不溶性杂质。 (2)再生是指将用过的离子交换剂恢复原状的 处理过程。
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2、缓冲液的选择
(1)对于两性蛋白质 来说,缓冲液的pH决定 蛋白质在该缓冲体系下 所带的电荷, 以一个pI为5的蛋白为 例:
+
等电点
蛋
白
吸附阴离子交换剂
质
净
pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
电
荷 吸附阳离子交换剂
图2 蛋白质静电荷与pH的关系
pH < pI(+) pH = pI(0) pH > pI(-)