实验三_溶菌酶的提取和结晶

实验三溶菌酶的提取和结晶

一、实验目的

学习从鸡蛋清中提取和纯化溶菌酶的方法。

二、实验原理

溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数[ ]为13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。

溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。

三、实验器材

仪器：冰箱，pH计，pH试纸，冷冻离心机，恒温培养箱，恒温摇床，分光光度计，水浴锅，滤网（150目），滤纸，电子天平，漏斗，移液器。

试剂：新鲜鸡蛋清，1mol/L NaOH，溶菌酶，5%NaCl,无水丙酮

四、实验步骤

（1）选择新鲜鸡蛋，蛋清的PH值不能低于8.0。

（2）清洗：用水洗掉蛋壳表面的不洁之物。

（3）破壳分离蛋清。

（4）鸡蛋清均质：搅拌10 分钟，将蛋清搅拌稠度均匀即可，以不引起泡沫为宜，防止蛋白质变性。

（5）过滤：用3 层纱布将稠度均匀的蛋清液过滤，滤去残存的蛋壳及卵带。

（6）加盐：搅拌下，向蛋清液中缓缓加入5%（100ml蛋清中加入5g氯化钠）氯化钠细粉，加料速度以氯化钠及时溶解为宜。

（7）结晶：用1M 氢氧化钠溶液调PH 至9.5-10.0，边加边搅拌均匀，避免过碱引起蛋白质变性。然后加入晶种（晶种制备：将溶菌酶试剂配制成5%水溶液，每10ml 加入0.5g 氯化钠，滴加1M氢氧化钠溶液调PH10.0，置4℃冰箱种，结晶析出即可），在4℃冰箱中静置4 天，析出结晶，离心（4000r/min）10min分离得粗溶菌酶(称重)。

（8）溶解：称量粗溶菌酶20 倍重量的5%氯化钠溶液，加入到粗溶菌酶中，搅拌下加入1M 盐酸，调pH 至4.5，溶解30 分钟，离心除去不溶物。

（9）热变性除杂：将上述溶液搅拌下升温到70℃，保温20 分钟，迅速降温到室温，离心除去沉淀。

（10）重结晶：将除杂后溶液用1M 氢氧化钠溶液调pH 至10.0，加入少许晶种，放入冰箱中，4℃下静置4 天，离心得溶菌酶结晶。

（11）干燥：用10 倍的丙酮将溶菌酶结晶共洗涤三次，过滤，溶菌酶结晶放入真空干燥箱，40℃下干燥4 小时，称重。

作业

1．第一次得到的溶菌酶质量是多少？

2.分析实验中影响溶菌酶纯度的因素，记录下所得的精制溶菌酶的重量。

3．实验结果与分析。