疾病的基因治疗ppt课件
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基因治疗PPT课件
(一) 直接策略：
• 针对致病基因
(二) 间接策略：
• 导入与致病基因无直接联系的治疗基因
(一)直接策略
1. 基因矫正（gene correction） 2. 基因置换（gene replacement） 3. 基因增补（gene augmentation）
又称为补偿性基因治疗 4. 基因失活（gene inactivation）
1990年9月14日，世界首例基因治疗：SCID
感染性疾病的基因治疗
• 引入治疗基因来抑制病原繁殖
• 方法: 1. Anti-sense 2. Ribozyme RNA
肿瘤基因治疗临床试验方案
黑色素瘤 83 前列腺癌 44
基因治疗
Gene therapy
传统治疗方法
1. 药物治疗 2. 手术治疗 3. 放射治疗 4. 理疗
• 新的生物治疗： • 基因治疗(gene therapy)
基因治疗
一、概念 二、策略 三、基本流程 四、应用与展望
一、基因治疗的概念
• Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.
(3) 药物增敏基因治疗
• 将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对 药物的敏感性。
• 如将钙调素基因转入癌细胞，利用其对癌细胞 MDR的逆转作用，使癌细胞对化疗药物的敏感 性明显提高。
3. 其它策略
(1) 特异性细胞杀伤 (2) 多基因转染
特异性细胞杀伤
• 指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基 因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合 基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特 异性杀伤该肿瘤细胞。
• 针对致病基因
(二) 间接策略：
• 导入与致病基因无直接联系的治疗基因
(一)直接策略
1. 基因矫正（gene correction） 2. 基因置换（gene replacement） 3. 基因增补（gene augmentation）
又称为补偿性基因治疗 4. 基因失活（gene inactivation）
1990年9月14日，世界首例基因治疗：SCID
感染性疾病的基因治疗
• 引入治疗基因来抑制病原繁殖
• 方法: 1. Anti-sense 2. Ribozyme RNA
肿瘤基因治疗临床试验方案
黑色素瘤 83 前列腺癌 44
基因治疗
Gene therapy
传统治疗方法
1. 药物治疗 2. 手术治疗 3. 放射治疗 4. 理疗
• 新的生物治疗： • 基因治疗(gene therapy)
基因治疗
一、概念 二、策略 三、基本流程 四、应用与展望
一、基因治疗的概念
• Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells.
(3) 药物增敏基因治疗
• 将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对 药物的敏感性。
• 如将钙调素基因转入癌细胞，利用其对癌细胞 MDR的逆转作用，使癌细胞对化疗药物的敏感 性明显提高。
3. 其它策略
(1) 特异性细胞杀伤 (2) 多基因转染
特异性细胞杀伤
• 指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基 因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合 基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特 异性杀伤该肿瘤细胞。
基因治疗 PPT课件
(AAV), Herpes Simplex Virus (HSV-1), et al.
Non-virus method: Cyclodextrin Polymers, Lipids, Peptide, Antibodies, Aptamers,
and small molecules
■ Background
■ Background
Hybrid virus vector
HSV/AAV Ad/EBV HSV/EBV Ad/AAV Ad/retrovirus
Virus based transduction
■ Background
siRNA-based gene therapy
■ Background
Chemical modification
……
■ Background
Gene therapy Definition: Gene therapy is the use of DNA as a drug to treat
disease by delivering therapeutic DNA into a patient's cells.
Non-virus method
Can deliver both siRNA and plasmid DNA
■ Background
Conjugate delivery
Non-virus method
Dynamic PolyConjugates (DPC)
First reported in 2007 PEG: shielding effect GalNAc ligand was essential for both uptake by hepatocytes and in vivo silencing activity. Other targeting ligands has been explored, including peptides, antibodies, small molecules, glycans, lectins and nucleic acids.
Non-virus method: Cyclodextrin Polymers, Lipids, Peptide, Antibodies, Aptamers,
and small molecules
■ Background
■ Background
Hybrid virus vector
HSV/AAV Ad/EBV HSV/EBV Ad/AAV Ad/retrovirus
Virus based transduction
■ Background
siRNA-based gene therapy
■ Background
Chemical modification
……
■ Background
Gene therapy Definition: Gene therapy is the use of DNA as a drug to treat
disease by delivering therapeutic DNA into a patient's cells.
Non-virus method
Can deliver both siRNA and plasmid DNA
■ Background
Conjugate delivery
Non-virus method
Dynamic PolyConjugates (DPC)
First reported in 2007 PEG: shielding effect GalNAc ligand was essential for both uptake by hepatocytes and in vivo silencing activity. Other targeting ligands has been explored, including peptides, antibodies, small molecules, glycans, lectins and nucleic acids.
基因治疗PPT课件
象外科移植手术，切除病变部分，换上正 常健康基因，这在目前还难以做到
(二)基因取代或基因干预
基因置换 (gene replacement)
通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因
基因增补 (gene augmentation)
不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点 整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能
体细胞——目前常用体细胞有：
①淋巴细胞 ②骨髓细胞 ③内皮细胞 ④皮肤纤维细胞 ⑤肝细胞 ⑥肌细胞
附:选择靶细胞依据 ①疾病累及的主要部位。 ②靶细胞来源的难易程度。 ③体外培养的成活率和存活时间。 ④接受正常基因的能力。 ⑤新的正常基因能否在靶细胞能否
正常表达和持续时间。
⑦角化细胞(keratinoyte)
第二节
基因治疗的 基本原理
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
治疗性基因的选择
基因载体的选择 病毒载体 非病毒载体
载体与治疗基因 将重组DNA导入靶细胞,检测目 重组及筛选鉴定 的基因和标记基因的表达产物
靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
基因转移 间接体内疗法 直接体内疗法
1.吸附——病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸 附在膜受体上。
2.入胞——病毒核酸进入host细胞，逆转录，整合到 host DNA 中去，转录、复制
3.病毒颗粒成熟——病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟 病毒颗粒
4.病毒颗粒的释放——释放的子病毒又可感染其它细 胞，每个细胞可以释放105子病毒。
图11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图
一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
(二)基因取代或基因干预
基因置换 (gene replacement)
通过体内基因同源重组,原位替换病变细胞内的致病基因
基因增补 (gene augmentation)
不除去异常基因，向靶细胞导入外源基因通过非定点 整合，使其表达产物，从而弥补缺陷基因的功能
体细胞——目前常用体细胞有：
①淋巴细胞 ②骨髓细胞 ③内皮细胞 ④皮肤纤维细胞 ⑤肝细胞 ⑥肌细胞
附:选择靶细胞依据 ①疾病累及的主要部位。 ②靶细胞来源的难易程度。 ③体外培养的成活率和存活时间。 ④接受正常基因的能力。 ⑤新的正常基因能否在靶细胞能否
正常表达和持续时间。
⑦角化细胞(keratinoyte)
第二节
基因治疗的 基本原理
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
治疗性基因的选择
基因载体的选择 病毒载体 非病毒载体
载体与治疗基因 将重组DNA导入靶细胞,检测目 重组及筛选鉴定 的基因和标记基因的表达产物
靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞
基因治疗的基本程序(基本原理或基本步骤)：
基因转移 间接体内疗法 直接体内疗法
1.吸附——病毒衣壳糖蛋白与细胞膜受体特异性结合，吸 附在膜受体上。
2.入胞——病毒核酸进入host细胞，逆转录，整合到 host DNA 中去，转录、复制
3.病毒颗粒成熟——病毒核酸和病毒蛋白装配成成熟 病毒颗粒
4.病毒颗粒的释放——释放的子病毒又可感染其它细 胞，每个细胞可以释放105子病毒。
图11-2 Rous肉瘤病毒毒粒结构示意图
一.病毒载体——转基因的生物学方法
逆转录病毒载体
（一）逆转录病毒的生活（命）周期 （二）逆转录病毒的基因组结构 (三) 逆转录病毒载体结构功能特点 (四) 重组逆转录病毒载体结构 （五）重组逆转录病毒的制备 （六）重组逆转录病毒基因转移系统 （七）逆转录病毒载体介导基因转移的安全性问题
基因诊疗伦理课件ppt
尊重患者的隐私权
患者的基因信息应得到保护，避免被 泄露或滥用。
自主原则
自主决策
患者有权自主决定是否接受基因 诊疗，并且有权选择或拒绝任何 特定的诊疗方法。
自主知情
患者有权获得关于基因诊疗的所 有相关信息，包括诊疗目的、方 法、效果及可能的副作用等。
不伤害原则
避免伤害
在基因诊疗过程中，应采取必要的措施避免对患者造成身体 和精神上的伤害。
VS
详细描述
基因编辑技术可以用于人类胚胎编辑，但 这种技术可能带来严重的后果，如生殖细 胞遗传改变、种族灭绝等。因此，国际社 会对此存在广泛的争议和讨论，需要制定 严格的伦理规范来规范和控制此类技术的 应用。
04
基因诊疗伦理决策与建议
个人决策的考虑因素
患者的知情同意
确保患者在充分了解基因诊疗 的目的、过程和潜在风险后， 自主做出是否接受诊疗的决策
公共利益与资源分配
在资源有限的情况下，需要平衡公共利益和资源分配的公平性，确 保资源能够最大化地用于最需要的人群。
长期影响与风险评估
除了考虑短期的利益和风险外，还需要评估基因诊疗对个体和社会 的长期影响，以及潜在的伦理风险。
针对不同基因疾病的伦理建议
1 2 3
遗传性疾病的预防与控制
对于遗传性疾病，应注重预防和控制，通过提供 准确的遗传咨询、采取有效的预防措施等，减少 遗传性疾病的发生。
加强伦理审查和监管
02
建立有效的伦理审查机制和监管体系，对基因诊疗技术进行严
格的审查和监管，确保技术的安全性和有效性。
促进公众参与和沟通
03
加强与公众的沟通和参与，了解公众的关切和需求，引导公众
正确看待基因诊疗技术的发展和应用。
患者的基因信息应得到保护，避免被 泄露或滥用。
自主原则
自主决策
患者有权自主决定是否接受基因 诊疗，并且有权选择或拒绝任何 特定的诊疗方法。
自主知情
患者有权获得关于基因诊疗的所 有相关信息，包括诊疗目的、方 法、效果及可能的副作用等。
不伤害原则
避免伤害
在基因诊疗过程中，应采取必要的措施避免对患者造成身体 和精神上的伤害。
VS
详细描述
基因编辑技术可以用于人类胚胎编辑，但 这种技术可能带来严重的后果，如生殖细 胞遗传改变、种族灭绝等。因此，国际社 会对此存在广泛的争议和讨论，需要制定 严格的伦理规范来规范和控制此类技术的 应用。
04
基因诊疗伦理决策与建议
个人决策的考虑因素
患者的知情同意
确保患者在充分了解基因诊疗 的目的、过程和潜在风险后， 自主做出是否接受诊疗的决策
公共利益与资源分配
在资源有限的情况下，需要平衡公共利益和资源分配的公平性，确 保资源能够最大化地用于最需要的人群。
长期影响与风险评估
除了考虑短期的利益和风险外，还需要评估基因诊疗对个体和社会 的长期影响，以及潜在的伦理风险。
针对不同基因疾病的伦理建议
1 2 3
遗传性疾病的预防与控制
对于遗传性疾病，应注重预防和控制，通过提供 准确的遗传咨询、采取有效的预防措施等，减少 遗传性疾病的发生。
加强伦理审查和监管
02
建立有效的伦理审查机制和监管体系，对基因诊疗技术进行严
格的审查和监管，确保技术的安全性和有效性。
促进公众参与和沟通
03
加强与公众的沟通和参与，了解公众的关切和需求，引导公众
正确看待基因诊疗技术的发展和应用。
遗传病基因治疗PPT课件
糖尿病
采用基因疗法，将胰岛素基因导入患者肝脏细胞中，以实现胰岛素的持续分泌。
染色体异常遗传病基因治疗
唐氏综合征
通过基因疗法修复或替代患者细胞中 多余的21号染色体上的基因，以改善 患者的症状。
威廉姆斯综合征
采用基因疗法，激活或替代患者细胞 中缺失的7号染色体上的基因，以促 进患者的生长发育和智力发展。
在遗传病基因治疗中，需要关注社会舆论的动态变化，加强科普宣传和公众教育，提高公众 对遗传病基因治疗的认知和理解水平。同时，也需要关注不同利益相关方的诉求和关切，促 进多方参与和合作，共同推动遗传病基因治疗技术的健康发展。
06
总结与展望
当前遗传病基因治疗成果回顾
多种遗传病得到有效治疗
通过基因疗法，已成功治疗了多种遗传病，如囊性纤维化、视网 膜色素变性等。
治疗领域的发展。
培养专业人才
03
加强对遗传病基因治疗领域专业人才的培养和引进，提高整体
研究水平和治疗效果。
THANKS
感谢观看
技术一
CRISPR-Cas9基因编辑技术， 可实现对特定基因的定点编辑。
技术三
诱导多能干细胞（iPSC）技术， 可生成患者自体细胞用于基因 治疗。
技术五
RNA干扰（RNAi）技术，可 通过抑制特定基因的表达来治 疗疾病。
03
遗传病基因治疗应用实例
单基因遗传病基因治疗
腺苷脱氨酶缺乏症（ADA-SCID）
临床表现与诊断
临床表现
遗传病的临床表现多种多样，涉及全身各个系统和器官。常见的症状包括生长发育迟缓、智力障碍、 畸形、代谢异常等。由于遗传病的异质性，即使同一种遗传病在不同患者中的表现也可能存在很大差 异。
诊断方法
采用基因疗法，将胰岛素基因导入患者肝脏细胞中，以实现胰岛素的持续分泌。
染色体异常遗传病基因治疗
唐氏综合征
通过基因疗法修复或替代患者细胞中 多余的21号染色体上的基因，以改善 患者的症状。
威廉姆斯综合征
采用基因疗法，激活或替代患者细胞 中缺失的7号染色体上的基因，以促 进患者的生长发育和智力发展。
在遗传病基因治疗中，需要关注社会舆论的动态变化，加强科普宣传和公众教育，提高公众 对遗传病基因治疗的认知和理解水平。同时，也需要关注不同利益相关方的诉求和关切，促 进多方参与和合作，共同推动遗传病基因治疗技术的健康发展。
06
总结与展望
当前遗传病基因治疗成果回顾
多种遗传病得到有效治疗
通过基因疗法，已成功治疗了多种遗传病，如囊性纤维化、视网 膜色素变性等。
治疗领域的发展。
培养专业人才
03
加强对遗传病基因治疗领域专业人才的培养和引进，提高整体
研究水平和治疗效果。
THANKS
感谢观看
技术一
CRISPR-Cas9基因编辑技术， 可实现对特定基因的定点编辑。
技术三
诱导多能干细胞（iPSC）技术， 可生成患者自体细胞用于基因 治疗。
技术五
RNA干扰（RNAi）技术，可 通过抑制特定基因的表达来治 疗疾病。
03
遗传病基因治疗应用实例
单基因遗传病基因治疗
腺苷脱氨酶缺乏症（ADA-SCID）
临床表现与诊断
临床表现
遗传病的临床表现多种多样，涉及全身各个系统和器官。常见的症状包括生长发育迟缓、智力障碍、 畸形、代谢异常等。由于遗传病的异质性，即使同一种遗传病在不同患者中的表现也可能存在很大差 异。
诊断方法
《基因与疾病》课件
囊性纤维化
一种影响肺功能和消化系统 的常见遗传性疾病。
遗传性耳聋
由遗传突变引起的耳聋，可 遗传给后代。
基因治疗和基因编辑
基因治疗和基因编辑是治疗遗传性疾病的新方法。了解这些技术可以拓宽疾病治疗的途径。
1
基因治疗
通过向患者体内引入正常基因，修复异常基因功能，实现疾病的治疗。
2
基因编辑
利用CRISPR-Cas9等工具，直接编辑基因序列，纠正突变，实现精准治疗。
基因表达分析
研究基因的表达水平和调控机制， 为疾病的化医疗将基因组学技术与临床实践相结合，为每个患者提供定制化的诊断和治疗方案。
1 基因检测
通过基因检测了解患者的遗传信息，可以选择更精准的治疗方法。
2 药物选择
根据个体基因差异，选用最符合患者基因型的药物，提高疗效和降低风险。
基因的功能
基因的表达
基因参与细胞的生长、发育和功 能调控，对生物体具有重要影响。
基因的表达影响着生物体的性状， 决定了我们的外貌、特长和易感 疾病。
基因突变与疾病
基因突变是导致疾病发生的重要原因之一。理解基因突变对疾病的影响有助于提前预防、诊断和治疗。
1 遗传突变
由父母遗传而来的异常基 因导致一些常见遗传性疾 病，如先天性心脏病。
2 新生突变
在个体形成过程中产生的 突变，可能引发罕见遗传 性疾病，如帕金森病。
3 环境致突变
外界因素如辐射、化学物 质等可引起基因突变，增 加患病风险，如皮肤癌。
常见遗传性疾病
许多疾病与基因密切相关，如血友病、囊性纤维化等。深入了解这些疾病有助于提早预防和治疗。
血友病
一种由凝血因子基因突变引 起的遗传性出血性疾病。
3
基因诊断与基因治疗PPT课件
• 用于探测点突变时一般需要合成两种探针，一种与正常基因 序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列 杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定 杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只 有一个碱基发生了突变的基因区别开来。
• PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点 的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交， 这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因 组DNA就可进行。
• 根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探 针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及 寡核检测
• 核酸探针的常用酶促标记技术
–缺口平移 –DNA快速末端标记 –用T4多核苷酸酶标记DNA 5‘末端，随引物延伸 –聚合酶链反应
• 核酸探针的非放射性标记技术
1995年美国FDA批准Ad－P53肿瘤基因治疗等临床试验 的实施，标志着基因治疗已逐步进入一个正常的、目标明 确的理性化发展阶段。
• 18岁的格尔辛基（Jesse Gelsinger）因临床试验的某些 失误而于1999年9月17日死亡。格尔辛基是世界上首位由 基因治疗导致丧生的患者。他患先天性鸟氨酸甲酰氨基转 移酶（OTC）缺乏症（X连锁性遗传病）病症，在男性身 上较严重，往往引起新生男婴患者的死亡。
–光促生物素标记核酸 –酶促生物素标记核酸 –寡核苷酸的生物素末端标记 –酶标DNA –酶标寡核苷酸 –DNA半抗原标记
核酸分子杂交方法
• 核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂 交和液相杂交两种类型
• 固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定 在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶 液中，固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙 膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。
胞培养。从1982年起采取妊娠8-12周的绒毛DNA 作产前诊断使产前基因诊断的时间提前。由于 PCR技术的应用，甚至在胚胎植入前(受精6d)也可 作产前诊断。
• PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点 的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交， 这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因 组DNA就可进行。
• 根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探 针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及 寡核检测
• 核酸探针的常用酶促标记技术
–缺口平移 –DNA快速末端标记 –用T4多核苷酸酶标记DNA 5‘末端，随引物延伸 –聚合酶链反应
• 核酸探针的非放射性标记技术
1995年美国FDA批准Ad－P53肿瘤基因治疗等临床试验 的实施，标志着基因治疗已逐步进入一个正常的、目标明 确的理性化发展阶段。
• 18岁的格尔辛基（Jesse Gelsinger）因临床试验的某些 失误而于1999年9月17日死亡。格尔辛基是世界上首位由 基因治疗导致丧生的患者。他患先天性鸟氨酸甲酰氨基转 移酶（OTC）缺乏症（X连锁性遗传病）病症，在男性身 上较严重，往往引起新生男婴患者的死亡。
–光促生物素标记核酸 –酶促生物素标记核酸 –寡核苷酸的生物素末端标记 –酶标DNA –酶标寡核苷酸 –DNA半抗原标记
核酸分子杂交方法
• 核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂 交和液相杂交两种类型
• 固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定 在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶 液中，固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙 膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。
胞培养。从1982年起采取妊娠8-12周的绒毛DNA 作产前诊断使产前基因诊断的时间提前。由于 PCR技术的应用，甚至在胚胎植入前(受精6d)也可 作产前诊断。
《基因治疗》PPT课件
DNA复合物 3. 多聚物/DNA复合物 4. 其它方法
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 无毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不会在体内堆积 3. 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 4. 可带有不同的电荷 5. 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适
应不同的生理要求
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
（一）基因治疗的病毒载体
• 应该具有的基本条件： I. 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 II. 介导外源基因的转移和表达 III. 对机体没有致病能力
病毒载体的产生
➢ 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编 码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因 、包装容量等）
➢ 外源基因插入病毒基因组的非必须区 • 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 • 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（
2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
1. 裸DNA
• 方法：直接注射或基因枪轰击 • 溶液类型对基因表达有影响：
重组DNA可贮存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理盐水或PBS
2. 脂质体/DNA复合物
形成高效包装DNA的人造膜，与细胞膜极为相似。 形成脂质双层包围水溶液的脂质微球，与细胞融合后被
重症综合性免疫缺乏症（SCID）
腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的 致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多， 改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致 免疫缺陷
1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到 人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA） 缺乏症的4岁儿童） ，治疗SCID
细胞内吞。
人工脂质体膜具有如下特点
1. 无毒性和免疫原性 2. 可生物降解，不会在体内堆积 3. 可制成球状(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 4. 可带有不同的电荷 5. 具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适
应不同的生理要求
3. 多聚物/DNA复合物
• 阳离子多聚体 • DNA带负电 • 细胞表面带负电
（一）基因治疗的病毒载体
• 应该具有的基本条件： I. 携带外源基因并能组装成病毒颗粒 II. 介导外源基因的转移和表达 III. 对机体没有致病能力
病毒载体的产生
➢ 充分了解载体病毒的基因组结构和功能（编码区/非编 码区、结构蛋白/非结构蛋白、必须基因/非必须基因 、包装容量等）
➢ 外源基因插入病毒基因组的非必须区 • 致病基因（裂解细胞、癌基因使细胞转化）删除 • 插入外源基因长度受限删除非必须基因/必须基因（
2．种系细胞的基因治疗：在生殖细胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修复缺陷基因 以校正遗传缺陷。引入的外源基因（整合到基因组） 能遗传给后代。
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血友病是目前SGT最有希望达到 理想疗效的遗传病病种
•现行血友病B治疗手段、效果不理想 •单基因遗传病 •不需要精确的表达调控，无需所有细胞表达 •表达广谱 •理想的动物模型（二个狗品系，3个小鼠品系） •疗效易于评价 血友病A：100-200ng/ml 血友病B: 5000ng/ml
血友病B基因治疗靶细胞选择
FAXW(小剂量组) FAXW(静脉缓慢注射组) FAXW(大剂量组) FUXW组 PBS对照组
重组FAXW.FUXW病毒在血友病B小鼠体内表达 hFIX的时效曲线
宫内胎鼠基因治疗
•非病毒途径导入基因：尾静脉大容量快速注射法
尾静脉大容量快速注射裸DNA能够介导外源基因在动物肝内高效表达， 我们以凝血因子Ⅸ（hFⅨ）为报告基因建立了尾静脉液压法裸质粒 转移体系。
400
6
300
200
100
0 weeks 0 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
mFIX level (ng/ml) -3 13 29 45 65 89 111 135 161 187 220 281 350
Expression of mFIX in Hemophilia B Mouse
2、血友病B基因治疗的实践与发展
血友病B（ Hemophilia B） 是一种由于凝血因子IX基因 （hFIX）发生突变而引起的出血 性疾病。其症状表现为自发性出 血，严重者可因关节出血导致关 节变形和残废甚至死亡。该病为X 染色体连锁，在男性中发病率大 约为1/100,000。
血友病目前的临床治疗方法：
ex vivo:
皮肤成纤维细胞 角质细胞 内皮细胞 上皮细胞 成肌细胞 造血干细胞 骨髓基质细胞 支持细胞
In vivo:
直接、连续注射
尽管人体天然的FVIII和FIX都是由肝 细胞产生的。然而，实验证明，由非肝 细胞如CHO产生的重组凝血因子与人体 天然的凝血因子在活性和免疫原性上没 有差别，到目前为止没有发现非肝细胞 产生的凝血因子有不同寻常的翻译后修 饰。
疾病的基因治疗
复旦大学 遗传学研究所 薛京伦 2003，10
基因治疗几个发展时期
1980-1989 准备期 1990-1995 狂热期 1996-至今 理性期
技术、宗教，伦理，法律 公众，媒体 出现临床结果
人体基因治疗是一个多环节的复杂过程
•基因导入靶器官、靶组织、靶细胞间的交流 •基因表达水平和时空调控 •基因表达产物生物活性 •载体安全性 还存在许多迷惑和问题
HIV是基因组结构及基因
调节机制最为复杂的逆转 录病毒之一,基于HIV的重 组反转录病毒载体，能广 泛感染各种非分裂细胞,也 保留了能够整合在宿主染 色体上的特点.且免疫反应 小,重组HIV是一个很有发 展潜力的病毒载体
50
40 30 20 10
0 5 10 15 20 30 40 50 60 时间/天
600
C2C12
500
400
300
200
100
0
Plasmids CIX CIXR Cm
CmR
Em
EmR
Bm
In vitro Expression of AAV/mFIX
mFIX level (ng/106cells/24 h)
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Treated hemophilia B mice 48.33+/-15.46
7.5+/-3.56 34.58+/-4.29 34.2+/-4.17
Bleeding Assay
3.2' <40ul APTT <20''
30‘ 430ul APTT >100"
7.5‘ 50ul APTT 34"
抗IX因子抗体分析
mFIX in vivo expression
800
A
700
B
600
C
D
500
E
400
F
G
300
H
200
I
100
0
days post injection
血友病小鼠经rAAV基因治疗后, FIX凝 血活性提高, 出血症状改善
Table1. Bleeding times and clotting functional assays
C57 mice
Blood lost over 5min （ul） Bleeding times（Min） APTT（Sec） IX activity（％）
36.67+/-14.04
3.17+/-1.11 20 70~130
Hemophilia B mice
428.33+/-51.69
>30 >100 <3
蛋白替代法：输血、输凝血酶原、注射重 组FVIII， FIX，能有效地改善出血症状和 延长生命，但是昂贵，且存在感染HIV， HBV（乙肝），HCV（丙肝）风险
蛋白替代法可导致抑制物产生，从而使治疗失效 血友病A 有10 -40% 的人群产生抑制物 血友病B 有5% 的人群产生抑制物
这也是我们把治疗的目光投在比蛋白替代法可能更优越 的基因治疗的原因之一！
输血减少 50% 输血减少 80% 没有变化
2）2003年，以AAV-2/hFIX介导的直 接肌肉注射，基因治疗血友病B方案 已被批准临床试验（国家药品监督管 理局药物临床批件，2003L00403）
重组AAV载体
ITR CMV
hFIX minigene
PA ITR
pAVChFIXm
ITR CMV ITR CMV
0天 3天 15天 27天 39天 阳性对照
采用Western dot-blot分析表明，于肌 肉注射rAAV/hFIX病毒子后第15天，小鼠 血液中即开始出现抗hFIX抗体，血浆中 hFIX水平亦开始下降. 经Bethesda分析,未发现抗小鼠IX因子抗 体.
抗AAV抗体检测
中和抗体(倍数)
10
血友病 Bห้องสมุดไป่ตู้基因治疗动物实验比较
单位
载体
基因
启动子
动 物 模 型 FIX 表 达 持 续 时 间
FIX:Ag FIX:C (ng/ml) ( %)
症状
复 旦 大 学 AAV hFIXm
复 旦 大 学 AAV hFIXm R338A
复 旦 大 学 AAV mFIX
宾 州 大 学 AAV hFIX
宾 州 大 学 AAV cFIX
因此，肝细胞不一定是血友病基因治 疗必然的靶细胞。
1）1991年，复旦大学反转录病毒
介导的ex vivo途径临床试验取得
了安全有效的结果
反转录病毒载体
5‘LTR FIX cDNA
Neo S Ori P Ori 3’LTR
XL－IX
5‘LTR
Neo
CMV FIX cDNA
3’LTR
N2CMV－IX
肝脏输注
250 482 550
70 1800 <95
6.0
27 天 出 血 减 少
34.2 >13 周 凝 血 正 常
27.5 >350 天 凝 血 正 常
5-7
>1 年
无法观察
1.4
2.5 年 凝 血 时 间 缩 短
25 >17 月 纠 正 出 血 症 状
1% >240 天 部 分 纠 正
3）以其他载体系统进行血友病B基因治疗
hFIX血浆表达量
800
700
600
500
400
300
200
100
0
293T
L-02
BHK
细胞类型
FUXW FAXW
重组慢病毒载体 FUXW FAXW感染离体细胞 293T 、L-02、 BHK 72h后的hFIX蛋白表达
ABP肝特异性启 动子指导人的凝 血因子IX的重组 HIV载体：重组慢 病毒载体质 FUXW,FAXWD等
血友病 B 基因治疗临床试验比较
患者 单位 载体 基因 启动子 靶细胞组织 治疗策略 FIX:C(%) 临床症状
治疗前 治疗后
LD 复旦 RV hFIX LTR 成纤维细胞 ex vivo 2.2 5.9 出血,输血减少 LW 复旦 RV hFIX LTR 成纤维细胞 ex vivo 2.4 4.1 输血量减少 ZL 复旦 RV hFIX CMV 成纤维细胞 ex vivo 1.8 4.1 按鼻止血;出
早期期望值过高，目前理论研究和技 术的发展水平均还不能满足成功临床试 验的需要，安全性问题还一直没有彻底 解决。然而，目前对许多疾病分子机制 和对基因载体的研究取得了长足的进步， 为基因治疗较大范围临床试验开展打下 了坚实的基础。
选择
•在治疗上合适的基因——已知其在某 特定疾病中的病理、生理作用
•微小腺病毒载体介导hFIX小基因离体表达
ªÑ ¬½ ÐÖ FIX¬º ¿Á (ng/ml)
800 700 600 500 400 300 200 100
0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 5 6 7 8 9 10 11
ÜÖ
miniAdcFIX AdcFIX control
ELISA方法检测微小腺病毒(miniAd)及第一代腺病毒(firstAd)介导cFIX在血友病B小 鼠血浆中的表达
mFIX
PA ITR
pAVCmFIX
hFIX R338A
PA ITR
pAVChFIXmR
Transient Expression of pAAV-hFIXs in Cell Lines