汇总 western blotting实验方法

Western blotting试验方法

1.试剂配制

1.1配胶溶液

（1）

Tris (MW121.14) 12.11g

双蒸水80ml（定容至100ml）

溶解后，用浓盐酸（5-10ml）调pH至6.8，最后用双蒸水定容至100ml，高温灭

菌后室温下保存。

（2

Tris (MW121.14) 45.43g

双蒸水200ml（定容至250ml）

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用双蒸水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

（3

SDS 10g

双蒸水至100ml

（4

过硫酸胺0.1g

双蒸水 1.0ml

（5

丙稀酰胺（Acr）29g

甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g

双蒸水至100ml

溶解后（37℃助溶），用NaIgene滤器(0.45μm孔径)过滤，检测溶液的pH值不大于7.0，4℃置棕色瓶中保存，使用时恢复至室温且无沉淀。

（6

分装使用，避光保存，剧毒，挥发。

1.2其它溶液

（1

（2购买

（3可购买

1.0mol/L Tris·HCl（PH 6.8）10ml

SDS 4g

甘油20ml

DTT 3.12g

溴酚蓝0.04g

50ml

（41×）

Tris（MW121.14）7.55g

甘氨酸（MW75.07）188g

SDS 2.5g

双蒸水100ml（定容至500ml）

先加100ml双蒸水，磁力搅拌至完全溶解，定容至500ml，室温保存。外槽电泳液可反复使用3次。

（51×）

Tris（MW121.14）7.5g

甘氨酸（MW75.07）37.54g

双蒸水200ml（定容至250ml）

磁力搅拌至完全溶解，加双蒸水至250ml；临用前加甲醇至终浓度20%（50mlA+350ml 水+100ml甲醇），室温保存，此溶液可重复使用3～5次。

（6

考马斯亮蓝G250：100mg

95％乙醇：50ml

85%正磷酸：100ml

双蒸水至1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。分装使用，-20°C保存。

（71×）

丽春红S 2g

三氯乙酸30g

磺基水杨酸30g

双蒸水至100ml

可反复使用3-5次。

（8

Tween20 20ml

双蒸水至100ml

混匀后4℃保存。

（91×）

Tris 12.1g

NaCl 40g

双蒸水至500ml

高压灭菌，室温保存。待配置TBST缓冲液使用。

（100.05％Tween20的TBS缓冲液）

20％Tween20 500μl

10×TBS 50ml

双蒸水450ml

混匀后即可使用，最好现配现用。

（11

KCl 0.2g

KH2PO4 0.2g

NaCl 8g

Na2HPO4 2.08g

双蒸水1000ml

溶于800ml双蒸水中，用浓盐酸调整PH至7.2，再定容至1L，高温灭菌后，4℃保存。（12）封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）

脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g

TBST 100ml

（13）5%BSA（牛血清白蛋白）

BSA 0.5g

TBST 10ml

（14）一抗购买

（15）二抗购买

（16）显影液（5×）

自来水（加热至50℃）375ml （以下药品加到温水中）

米吐尔 1.55g

亚硫酸钠（无水）22.5g

碳酸钠（无水）33.75g

溴化钾20.95g

双蒸水至500ml

配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用双蒸水稀释至1×。

（17）定影液

自来水（50～60℃）700ml （以下药品加到温水中）

硫代硫酸钠240g

亚硫酸钠（无水）15g

冰乙酸12.6ml

硼酸7.5g

钾明矾15g（水温冷至30℃以下时再加入）加双蒸水定容至1000ml，室温保存

2.蛋白样本提取制备

2.1 细胞组织裂解

2.1.1细胞裂解

裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择

细胞裂解操作方法：

1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗

2 次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）。

2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask;

0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2 flask)。

3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中。

4 4℃摇动30 min。

5 4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力）。

6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。

2.1.2组织裂解

组织裂解操作方法：

1 取10-20mg组织，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解。

2 将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

3 先加蛋白酶抑制剂，再加预冷裂解液，按照组织和裂解液配比（1mg：30μl）加入，至最终蛋白浓度约为100/3mg/ml，置于冰浴上匀浆，几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎，裂解30min。（裂解液体积与组织样本量有适当比例，最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml)。

4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。（置于－20℃保存，可以保存半年）

2.2 蛋白定量

2.2.1 BCA法测定方法如下:

A．酶标板操作

1. 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂：

2. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA 工作液，充分混匀；

3. 标准各管中加入1000μL BCA工作液；各管充分混匀；稀释待测样品至合适浓度（1:20），样品稀释液总体积为100μL，加入BCA工作液1000μL，充分混匀；

4. 取70μL 各标准液和样品液到96孔板中，设置3个重复，37℃避光放置30分钟（孵育结束后可见颜色变化），然后在562nm下比色测定。以标准曲线0号管做参比，在562nm 波长下比色，记录吸光值；以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；

6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。

B．分光光度计测定

1. 标准曲线的绘制：各管按照下表加入试剂：