实验十六、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用

实验十六:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用

【实验名称】：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用

09救援一班第三大组李岚宇2009222336

室温：25℃

（一）实验目的：1、学习和掌握竞争性抑制作用的特点。

2、观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。

（二）实验原理：化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。琥珀酸脱氢酶是机体内参与三羧酸循环的一种重要的脱氢酶，其辅基为FAD，如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。

丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。

（三）实验材料与仪器：

1器材大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、恒温水箱、电热水浴锅

2试剂0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L 丙二酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液、0.02％甲烯蓝、液体石蜡。

（四）实验步骤:

1、酶提取液的制备：去大白鼠的肝脏、心脏、肾脏，用冷水洗3次，加入1/15mol/L磷酸缓冲液pH 在7.4。在匀浆器中进行匀浆，然后用纱布过滤，用干净的烧杯收集过滤的备用。

2、取试管6支，编号，在按图步骤操作，

酶提取液（ml）磷酸

缓冲

液

（ml）

0.2mol/L

琥珀酸

（滴）

0.02mol/

L琥珀酸

（滴）

0.2mol/L

丙二酸溶

液（滴）

0.02mol/L

丙二酸溶液

（滴）

蒸馏

水

（滴）

甲烯

蓝

（滴

）

褪色时间

（分钟）

试管1 2 - 8 - - - 8 3 3分33秒试管2 2 - 8 - - 8 - 3 5分30秒试管3 2 - 8 - 8 - - 3 6分04秒试管4 2 - - 8 8 - - 3 7分28秒试管5 - 2 8 - - - 8 3 无限大试管6 2 - 8 - - - 8 3 无限大试管6，在酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min。

各管溶液立即混均匀，沿试管壁加入液体石蜡，约0.5cm，各管置于37℃的水浴中保温，切勿摇动试管，随时观察比较各试管颜色的变化，记录褪色时间。

（五）实验结果记录：

表1

（六）实验讨论：

1、酶提取液中有琥珀酸脱氢酶活性，表1所示，在试管1中没有抑制剂，但琥珀酸依然能脱氢，使得甲烯蓝反应得甲烯白。

2、各管的褪色有明显的时间差别，褪色时间随[I]/[S]逐渐增大，而增大。

3、丙二酸对琥珀酸脱氢酶抑制作用的类型是竞争性抑制，其特点：最大反应速率Vmax不变，米氏常数Km增大，竞争性抑制可以通过增大底物浓度来减轻抑制程度。

4、本实验中5号、6号试管的作用是做对照，5号试管和1号试管做对照，说明酶提取液中有琥珀酸脱氢酶的存在，6号试管中的酶提取液在100℃的水浴加热煮沸过，所以琥珀酸脱氢酶是失活的。

【注意事项】：

1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。

2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气中的氧气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要倾斜，注意不要产生气泡。

3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空气中的氧气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重新氧化成蓝色。

4.、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管的褪色情况。

5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体石蜡。

2010年10月9号