琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
实验三：琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制 南京医科大学
3、丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
FAD
FADH2
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎＋海沙（研磨成糜状）
＋12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) （两次，研成糊状）；纱布过滤
２、酶促反应及竞争抑制作用
试剂（滴） １ ２ ３ ４ ５
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4--
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀，加石蜡5滴隔绝空气， 37℃水浴
保温，观察褪色情况。（斜执试管，沿壁缓慢加， 不要产生气泡）
四、结果、讨论： 阴性对照
编号 １
２
３
４
５
时间
10min
20min
30min 40min 50min 60min
褪色快
不褪色 褪色缓慢 不褪色 不褪色
五、注意事项：
1 、充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清 洗，注意回收。
2 、滴加液体石蜡。(实验结束,试管用洗衣粉刷净) 3 、观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制[原理]肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。
反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。
丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。
丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。
抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。
本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。
CH2COOHCH2 COOH FAD MB•2H（甲烯白）琥珀酸琥珀酸脱氢酶CHCOOHHOOCCH FADH2MB（甲烯蓝）延胡索酸[试剂]1．0.2mol/L琥珀酸: 取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。
2．0.02mol/L琥珀酸: 取1液稀释10倍。
3．0.2mol/L丙二酸: 取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。
4．0.02mol/L丙二酸: 取3液稀释10倍。
5．1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲: 1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml 混合即成。
（1）1/15mol/LNa2HPO4溶液: 取Na2HPO4.12H2O （MW：358.14）23.876 克, 加水至1000ml。
（2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml.6．0.02％甲烯蓝溶液7．液体石蜡[主要器材]1．新鲜猪心2．玻璃研钵3．漏斗4．手术剪5．棉花6．恒温水浴箱[操作步骤]1．心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g，用蒸馏水清洗后剪成碎块，置于研钵中，加入适量净沙，研磨成糜状。
再加1/15mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液12ml，研成糊状，用棉花过滤，滤液即为猪心提取液。
(自改)酶的竞争性抑制作用
本实验中5号、6号试管的作用是什度。
注意随时观察各管褪色情况。 37℃水浴保温过程中，不能振摇试管，避免 甲烯白重新氧化变蓝。
实验结束后，一定要洗净试管内的液体石蜡。
生物化学与分子生物学实验 CQMU
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的 竞争性抑制作用
P、97
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
目的： P、97
原理：1、概念：丙二酸（I）与琥珀酸（S）结构相似，竞争结合 琥珀酸脱氢酶活性中心，抑制酶活性。 2、竞争性抑制特点： P、98 ① Vm不变，Km ↑ ；
② E 的抑制程度
3. 结果及分析
试管编号 1 2 3 4 5 6
各管均在最后加入琥珀酸。并且立即混匀， 沿管壁加入石蜡油约0.5 cm厚，37 ℃水浴保温 （不摇动）。随时观察记录褪色所需时间
计算各管[I]/[S]
完全褪色 所需时间
P.99 酶提取液中有没有琥珀酸脱氢酶活性？
各管的褪色情况有何区别？为什么？ 丙二酸对琥珀酸脱氢酶抑制作用的类型及其特点是什么？
∝ [I]/[S]
；
③ [S]足够大，抑制解除。 3、观察： 操作：1、酶提取液的制备 2、取试管6支，按表所列步骤操作。 3、实验结果及分析 注意事项 ：
一、实验目的
学习和掌握酶竞争性抑制的概念和特点 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑 制作用
二、实验原理
酶的竞争性抑制作用
抑制剂和底物的结构相似，可 与底物竞争酶的活性中心，阻碍 酶-底物复合物的形成。
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑 制剂与底物浓度的相对比例（[I]/[S]）
● Km和Vmax的求法 底物浓度曲线是双曲线。
实验十 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验十琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制一、实验目的1、掌握竞争性抑制概念及作用机理。
2、了解在无氧情况下观察脱氢酶作用的简单方法。
二、实验原理存在于心肌、骨骼肌、肝脏等组织中琥珀酸脱氨酸，能使琥珀酸脱氢而成延胡索酸，脱下氢可使甲烯蓝退色，还原为甲稀白。
反应如下：草酸、丙二酸等在结构上与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酸的活性中心结合。
若酶已与丙二酸等结合，则不能再与琥珀酸结合而使之脱氢，产生抑制作用，且抑制程度取决于琥珀酸与抑制剂在反应体系中浓度的相对比例，所以这种抑制是竞争性抑制。
本实验通过观察在由不同浓度的琥珀酸与丙二酸组成的反应体系中使等量甲稀蓝退色反应时间，从而验证丙二酸对琥珀酸的竞争性抑制作用。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
三、实验仪器、材料和试剂1、仪器：恒温水浴锅，研钵或组织匀浆机2、材料和试剂（1）新鲜兔肝（2） 0、10mol/L磷酸盐缓冲液（pH7、4）：0、1mol/L NaH2PO419 ml 加0、1mol/LNa2HPO481ml。
（3）0、093 mol/L琥珀酸钠溶液：取琥珀酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。
（4）0、10 mol/L丙二酸钠溶液：取丙二酸钠1、5g溶于100 ml蒸馏水中。
（5）0、02%甲稀蓝溶液。
（6）液体石蜡。
四、实验操作新鲜兔肝立即剪碎，放于组织匀浆机中研碎，加入pH7、4的0、10 mol/L磷酸盐缓冲液，制备成200 g/L的肝匀浆液备用。
取五支试管分别编号，按下表配制反应体系：试剂管号0、093 mol/l琥珀酸钠0、10 mol/l丙二酸钠0、10mol/l(pH7、4)磷酸缓冲液肝匀浆液0、02%甲烯蓝11ml2ml1ml3滴21、5ml0、5ml1ml1ml3滴31ml1ml2ml3滴42ml1ml1ml3滴51ml1ml1ml1ml3滴将各管溶液混匀后加一薄层液体石蜡后静置（此时不可摇动!），观察各管中的颜色变化，并记录各管颜色完全变化的时间。
实验三丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
+
I
EI [S]>>[I]：高浓度的底物可解除抑制
竞争性抑制作用特点 1、I结构常与S结构类似 2、I/S与酶的结合部位相同:酶的活性中心 3、[S]↑可以降低甚至消除抑制作用 4、(表观）Km值增大，Vm值不变
1/ 珀酸竞争琥珀酸脱氢酶
COOH CH2 CH2
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
FAD
COOH CH2 COOH
丙二酸
延胡索酸
COOH
FADH2
无 氧
甲烯蓝（MB） 甲烯白（MBH2） +FAD
三、实验材料、主要仪器和试剂 （Equipments , Materials and Agents）
• • • • • • • • • （一）主要仪器：离心机、恒温水箱。 （二）主要试剂： 1．0.2mol/L 琥珀酸 2．0.02mol/L 琥珀酸 3．0.2mol/L 丙二酸 4．0.02mol/L 丙二酸 上述四中溶液调节pH值为7.4。 5．0.02%甲烯蓝 6．1/15mol/L的Na2 HPO4
四、操作步骤（Operating Procedure）
1 酶的提取液的制备：将兔子处死，取出肝 脏，切成碎片后，放入乳钵中，每组取8g 左右，加入1/15mol/L的Na2 HPO4溶液 5ml研成糊状后，再加入5ml1/15mol/L的 Na2 HPO4溶液，混匀后，倒入离心管中， 2000转/分钟离心4分钟，取上清液转入其 它试管备用。
六、思考题：(Questions)
什么叫酶的竞争性抑制作用？举例说明在医 学上的应用。
七.注意事项：(Notices) 1．注意密切观察颜色变化。 2．加入各种试剂要注意看清标签， 不能混用各试剂瓶瓶盖。
实验5 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
生物化学实验之－－
实验五 琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
山东师范大学生命科学学院
【实验目的】
了解丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 作用。
【实验原理】
由于丙二酸与琥珀酸结构相似，可以竞争性 地抑制琥珀酸脱氢酶对于琥珀酸的脱氢作用。 在生物体内，肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶， 能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸，同时放出大 量能量供肌体利用。
【思考题】
1. 为什么酶液的提取要在冰浴中进行？ 2. 各管中美蓝的褪色情况有何不同？为什么？
氧化型（蓝色）
【器材与试剂】
（一）器材 1. 恒温水浴锅 3. 研钵 5. 试管架 7. 漏斗 9. 脱脂棉 2. 手术剪 4. 试管 6. 刻度吸管 8. 小白鼠的肌肉 10. 吸水纸
（二）试剂 1. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4） 2. 0.02mol/L丙二酸钠溶液 3. 0.02mol/L琥珀酸钠溶液 4. 0.01%美蓝溶液 5. 生理盐水 6. 液体石蜡
—
1 2 5
1
— 2 5
—
1 2 5
3. 将各试管摇匀，倾斜试管，沿管壁滴加 液体石蜡5滴，盖在液面，以隔绝空气。置于 370C水浴中保温，随时观察各管中美蓝的褪色 情况，并记录时间，解释结果。
【要点提示】
1. 提取酶液需在冰浴中进行，以防酶失活。 2. 实验过程中，需快速加入试剂，摇匀后迅 速加入液体石蜡。 3. 加液体石蜡的目的是为了使反应液与空气 隔绝，因此加液体石蜡时需斜执试管，沿管壁 加入，不要产生气泡。 4. 加完液体石蜡后，在观察结果的过程中， 不要摇动试管，以免溶液与空气接触而使美蓝 重新氧化变蓝。
琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察
1.琥珀酸脱氢酶作用及竞争抑制的观察2.紫外分光法测定核酸含量本实验分组为15组，如果为16组，相应材料要增加。
需要的试剂配制方法注意事项1.5%琥珀酸钠溶液7.5g琥珀酸钠→500ml→15小瓶没有琥珀酸钠则用琥珀酸代替后用NaOH调和至PH7.01%丙二酸钠5g丙二酸钠→500ml→15小瓶没有丙二酸钠则用丙二酸代替后用NaOH调和至PH7.00.02%甲稀蓝0.1g甲稀蓝→500ml→15小瓶（棕色瓶）甲稀蓝别名亚甲酰蓝1/15mol/L Na2HPO4 23.6g Na2HPO4 →2000ml→15大瓶石蜡油可以不用分装每个房间在水浴锅前放1个核酸称一定量的小牛胸腺DNA融入0.1%的NaOH5-50ug/mL浓度羊的心脏切碎成小块大约2g左右提前购买，将皮、脂肪处理掉分割后放在冰箱里石英砂均匀的撒在上面注：每三个人一组，分为15组。
如果人数多可以适当多分几瓶试剂。
所需仪器所需数量40ml试剂瓶4560ml试剂瓶15试管4x152x15 共90个移液管（优先10ml的本次用5ml移液管）15研钵15种类数量心脏提取液151.5%琥珀酸钠151%丙二酸钠150.02%甲稀蓝15蒸馏水15液体石蜡 2胶头滴管共77个紫外吸收法测定核酸含量1、实验目的：1.掌握紫外吸收法测定核酸含量的原理2.掌握利用紫外线分光度计测定核酸含量二、实验原理：DNA和RNA都有吸收紫外线的性质，最大吸收峰在260nm波长处紫外线吸收是嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（－C＝C一C＝C 一），能够强烈吸收250~280nm 波长的紫外光。
等书上112页三、实验试剂与器材DNA样品紫外分光光度计四、实验步骤1.取DNA样品5ml，于紫外分光光度计上测定260nm与280nm处的OD值按下式按下式计算核酸浓度计算核酸浓度 DNA的质量浓度(mg/l)=OD260nm/0.020xL x稀释倍数计算核酸纯度=OD260nm/OD280nm2.取DNA样品5ml，沸水浴中加热5min于紫外分光光度计上，测260nm处的OD值比较DNA前后吸光度OD的差异。
生化实验课 琥珀酸脱氢酶
二、实验原理
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀 酸竞争，而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶 已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种 现象称为竞争性抑制。如相对地增加琥珀酸的浓度， 则可减轻丙二酸的抑制作用。
三．器材与试剂
1. 器材 大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、 量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、 恒温水箱、电热水浴锅 2. 试剂 0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶 液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L丙二 酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）、 0.02％甲烯蓝、液体石蜡
四.操作步骤
1. 酶提取液的制备： 取大白鼠的肝脏、心脏、肾脏，称重?，用 冷水洗3次，剪小块。加入10X(重 量)1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4），在匀 浆器中进行匀浆（最大速度1-2分钟），然 后用4层纱布过滤，滤纸过滤 (4000RPM10MIN)，用干净的烧杯收集过滤 液，备用。
试管3
试管4 试管5 试管6
ห้องสมุดไป่ตู้
2
2 2
2 -
8
8 8
8 -
8
8 -
-
8 8
3
3 3 3
注意：试管6中的酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min，再 加入其它溶液。各管中将溶液加入后立即混均匀。然后沿试管壁加 入液体石蜡，约0.5cm(1ml)厚。各管置于37℃的水浴中保温，切勿 摇动试管，随时观察比较各试管颜色的变化，记录褪色时间。
七．临床意义
竞争性抑制是可逆抑制过程,不破坏酶结构,不 改变酶浓度。 磺胺药与二氢叶酸结构类似，可竞争性抑制二 氢叶酸合成酶活性，进而减少菌体内四氢叶酸 的合成，达到抑制细菌生长的作用。
实验5-琥珀酸脱氢酶 ALT
分光光度计的使用
波长 样品池 读数 拉杆， 档 拉杆，1-4档 1. 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热20~30min 2. 1档（空白管）， 模式调 ），T模式调 档 空白管）， 模式调100%，显示“Blank”、 ，显示“ 、 “100” 3. 拉杆拉至1.5档，T模式下调 ，显示“0.00” 拉杆拉至 档 模式下调0%，显示“ 模式下调 4. 换到 模式，拉至 、3、4档，读取各个样品的吸光度 换到A模式 拉至2、 、 档 模式， 、分清光面、毛面。手应接触毛面， 比色杯 1、分清光面、毛面。手应接触毛面，光线从光面通过 2、用溶液润洗 次，装至 至4/5体积 、用溶液润洗2-3次 装至2/3至 体积 3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面 、粗纸吸水、 毛面 光面
血清谷血清谷-丙转氨酶活性单位
在pH 7.4、37℃条件下， 、 ℃条件下， 每毫升肝匀浆与底物保温30min后， 后 每毫升肝匀浆与底物保温 每生成2.5 µg的丙酮酸作为 每生成 的丙酮酸作为 1个谷 丙转氨酶的活性单位， 个谷-丙转氨酶的活性单位 个谷 丙转氨酶的活性单位， 血清中GPT正常值为 正常值为2-40 U/mL。 血清中 正常值为 。
实验7
实验十六、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
实验十六:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用【实验名称】：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用09救援一班第三大组李岚宇36室温：25℃（一）实验目的：1、学习和掌握竞争性抑制作用的特点。
2、观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
（二）实验原理：化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。
琥珀酸脱氢酶是机体内参与三羧酸循环的一种重要的脱氢酶，其辅基为FAD，如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。
若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。
如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
（三）实验材料与仪器：1器材大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、恒温水箱、电热水浴锅2试剂0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L 丙二酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液、0.02％甲烯蓝、液体石蜡。
（四）实验步骤:1、酶提取液的制备：去大白鼠的肝脏、心脏、肾脏，用冷水洗3次，加入1/15mol/L磷酸缓冲液pH 在7.4。
在匀浆器中进行匀浆，然后用纱布过滤，用干净的烧杯收集过滤的备用。
2、取试管6支，编号，在按图步骤操作，酶提取液（ml）磷酸缓冲液（ml）0.2mol/L琥珀酸（滴）0.02mol/L琥珀酸（滴）0.2mol/L丙二酸溶液（滴）0.02mol/L丙二酸溶液（滴）蒸馏水（滴）甲烯蓝（滴）褪色时间（分钟）试管1 2 - 8 - - - 8 3 3分33秒试管2 2 - 8 - - 8 - 3 5分30秒试管3 2 - 8 - 8 - - 3 6分04秒试管4 2 - - 8 8 - - 3 7分28秒试管5 - 2 8 - - - 8 3 无限大试管6 2 - 8 - - - 8 3 无限大试管6，在酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min。
实验十六、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
实验十六:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用【实验名称】：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用09救援一班第三大组李岚宇2009222336室温：25℃（一）实验目的：1、学习和掌握竞争性抑制作用的特点。
2、观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
（二）实验原理：化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。
琥珀酸脱氢酶是机体内参与三羧酸循环的一种重要的脱氢酶，其辅基为FAD，如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。
这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。
若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。
如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
（三）实验材料与仪器：1器材大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、量筒、烧杯、纱布、滤纸、试管及试管架、恒温水箱、电热水浴锅2试剂0.2mol/L琥珀酸溶液、0.02mol/L琥珀酸溶液、0.2mol/L丙二酸溶液、0.02mol/L 丙二酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲液、0.02％甲烯蓝、液体石蜡。
（四）实验步骤:1、酶提取液的制备：去大白鼠的肝脏、心脏、肾脏，用冷水洗3次，加入1/15mol/L磷酸缓冲液pH 在7.4。
在匀浆器中进行匀浆，然后用纱布过滤，用干净的烧杯收集过滤的备用。
2、取试管6支，编号，在按图步骤操作，酶提取液（ml）磷酸缓冲液（ml）0.2mol/L琥珀酸（滴）0.02mol/L琥珀酸（滴）0.2mol/L丙二酸溶液（滴）0.02mol/L丙二酸溶液（滴）蒸馏水（滴）甲烯蓝（滴）褪色时间（分钟）试管1 2 - 8 - - - 8 3 3分33秒试管2 2 - 8 - - 8 - 3 5分30秒试管3 2 - 8 - 8 - - 3 6分04秒试管4 2 - - 8 8 - - 3 7分28秒试管5 - 2 8 - - - 8 3 无限大试管6 2 - 8 - - - 8 3 无限大试管6，在酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min。
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制报告
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
一、实验原理
在化学结构上与底物类似的抑制剂，能与底物竞争酶分子的活性中心，从而抑制酶的活性。
抑制程度随抑制剂浓度的改变而改变。
如果底物浓度不变，酶活性的抑制程度随抑制剂浓度的增加而增加。
反之，如抑制剂浓度不变，则酶活性随底物浓度增加而逐渐回复，这种类型的抑制称竞争性抑制。
琥珀酸脱氢酶是一种含铁的黄酶，它可以催化琥珀酸脱氢酶，生成延胡索酸，在有氧的情况下，脱下的氢经呼吸链的传递，与氧化合成水。
肝中含有丰富的琥珀酸脱氢酶，体外实验在隔绝空气的情况下，琥珀酸脱下的氢可被人工受氢体一甲烯蓝接受还原成甲烯白。
因此我们可以用甲烯蓝被还原褪色的速度和程度，来了解不同底物浓度，不同抑制剂浓度时酶活性的改变。
二、实验步骤与结果
2.将上述各试管摇匀，于夜面上加液体石蜡10滴，放37℃水浴中保温，随时比较，观察
各试管颜色变化。
3.结果
经观察，各个试管的褪色时间顺序为：1>4>2>3
三、结论
底物浓度、抑制剂浓度影响了酶的竞争性。
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制目的与要求：了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中的竞争性抑制作用实验原理：肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变为延胡索酸（三羧酸循环，线粒体）。
反应中生成的FADH2可使甲烯蓝还原为甲烯白。
丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，与琥珀酸的分子结构相似，与酶的亲合力高。
丙二酸与酶结合后，酶活性受到抑制，则不能催化琥珀酸的脱氢反应。
本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。
操作步骤：酶提取液的制备酶促反应管的制备37℃酶促反应，观察甲烯蓝褪色程度实验结果：间隔10分钟，记录各管甲烯蓝褪色程度，解释结果。
注意事项：充分碾磨家兔肌肉，碾磨器械、纱布要及时清洗。
滴加液体石蜡时，倾斜试管，避免产生气泡。
观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝。
改良Mohum法测定谷-丙转氨酶活性目的与要求：了解Mohum法测定谷-丙转氨酶活性的原理及测定方法实验原理：利用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，在转氨酶作用下生成丙酮酸和谷氨酸，再利用2 4-二硝基苯肼与丙酮酸反应，生成棕色的丙酮酸二硝基苯肼，在520nm波长测定其光密度，与经同样处理标准丙酮酸溶液比较，即可计算谷-丙转氨酶的活性。
血清谷-丙转氨酶活性单位定义：每毫升血清在pH值7.4，37℃保温条件下与底物作用30min后，每生成2.5ug 的丙酮酸为1谷-丙转氨酶单位，正常值为2-40单位/ml。
实验步骤：见书Page 77酶活性测定表格。
实验结果：谷丙转氨酶活性单位A测定管/A标准管标准管中丙酮酸含量10/2.5。
注意事项：保温温度和时间要精确，即谷丙转氨酶发挥催化作用环境。
酶活性单位。
微量移液器的使用。
..。
琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
4.MTT法
实验操作：
(1)肝糜液的制备 用颈椎脱臼法处死小白鼠 将肝脏取出置于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充
分研磨至糊状 分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml 搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟 将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢
酶的肝糜液
实验操作：
另取中试管5支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定
3.TTC（氯化三苯四氮唑）法
无色TTC（2，3，5-氯化三苯基四唑）作为 人造受氢体，它在细胞呼吸过程中接受氢，还原 成三苯基甲膳（TF）。后者以红色晶体的形式存 在于细胞内，采用有机溶剂（如甲苯、乙酸乙醋 、三氯甲烷、丙酮或乙醇等）进行萃取。萃取液 测定485nm吸光度后，以TTC还原量表示脱氢酶 活性，根据标准曲线计算TF生成量，进而求出 TTC-脱氢酶活性
琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受 体的，另一种是作用于所有受体。
琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种 1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法 2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 3.TTC（氯化三苯四氮唑）法 4.MTT法 5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法
1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二 甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化 琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光 度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①Succinate＋ PMS→Fumarate＋PMSH2；②PMSH2＋DCPIP→PMS＋ DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这 种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化 与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出 SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧 化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算 SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定）/标准 =μmol/min/mg。
琥珀酸脱氢酶竞争性实验设计方案
1.酶的提取液的制备：将大白鼠处死，取骨骼肌， 切成碎片后，放入研钵中，每组取8g左右，加入 1/15mol/L的Na2 HPO4溶液5ml研成糊状后，再加 入5ml1/15mol/L的Na2 HPO4溶液，混匀后，用纱 布过滤，用干净的烧杯收集备用。
2.取试管5支，按照下列表格操作：
3.各管混匀后，沿试管的内壁加入石蜡油（隔绝空 气），放置到37℃水浴中保温，观察各管甲烯蓝的 褪色情况，并记录褪色的所需要的时间，解释其现 象。
1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。 2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气中的氧气 对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要倾斜，注意不要 产生气泡。 3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空气中的氧 气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重新氧化成蓝色。 4.、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管的褪色 情况。 5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体石蜡。
各管混匀后沿试管的内壁加入石蜡油隔绝空气放置到37水浴中保温观察各管甲烯蓝的褪色情况并记录褪色的所需要的时间解释其现1酶提取液的制备应操作迅速以防止酶活性降低
1. 掌握竞争性抑制的概念和特点。 2. 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。 3. 分析实验现象。
• 化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与底物竞争 结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚至丧失，这种抑制 作用称为竞争性抑制作用。琥珀酸脱氢酶其辅基为FAD， 如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱 氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色 的甲烯白。这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。 丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和 琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则 不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。如相 对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶实验报告
一、实验目的1. 理解琥珀酸脱氢酶在细胞代谢中的作用。
2. 掌握琥珀酸脱氢酶的活性测定方法。
3. 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
二、实验原理琥珀酸脱氢酶（SDH）是三羧酸循环（TCA循环）中的一个关键酶，其主要功能是催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，同时将脱下的氢传递给电子传递链。
本实验采用比色法测定琥珀酸脱氢酶的活性，通过观察甲烯蓝的脱色时间来反映酶的活性。
丙二酸作为竞争性抑制剂，其化学结构与琥珀酸相似，可以与琥珀酸竞争酶的活性中心，从而抑制琥珀酸脱氢酶的活性。
三、实验材料与仪器实验材料：1. 大肠杆菌2. 琥珀酸钠3. 甲烯蓝4. 磷酸缓冲液5. 丙二酸溶液6. 液体石蜡实验仪器：1. 试管2. 吸量管3. 电热水浴锅4. 恒温水浴箱5. 移液器四、实验步骤1. 菌液制备：将大肠杆菌接种于斜面培养基，37℃培养24小时，用无菌移液器取菌苔，加入5ml磷酸缓冲液，振荡混匀后，在离心机上以2500 r/min离心5分钟，弃去上清液，加入6ml磷酸缓冲液重悬菌体。
2. 酶活性测定：a. 取试管3支，分别编号为A、B、C。
b. 向A管中加入1ml菌液，B管中加入1ml菌液和1ml丙二酸溶液，C管中加入1ml菌液和1ml磷酸缓冲液。
c. 向各管中加入0.5ml琥珀酸钠和1ml甲烯蓝溶液。
d. 将试管放入恒温水浴箱中，在37℃下保温5分钟。
e. 将各管取出，立即在离心机上以5000 r/min离心5分钟，取上清液。
f. 用分光光度计在波长620nm处测定各管的吸光度值。
3. 计算酶活性：a. 计算A管和C管的平均吸光度值。
b. 计算A管和C管的吸光度比值。
c. 根据标准曲线计算琥珀酸脱氢酶的活性。
五、实验结果与分析1. 通过实验，成功制备了大肠杆菌菌液，并测定了琥珀酸脱氢酶的活性。
2. 加入丙二酸溶液的B管与未加丙二酸溶液的C管相比，吸光度值明显降低，说明丙二酸对琥珀酸脱氢酶具有竞争性抑制作用。
3. 通过计算，得出琥珀酸脱氢酶的活性为X单位。
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二、实验原理
酶的竞争性抑制作用
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抑制剂和底物的结构相似，可与 底物竞争酶的活性中心，阻碍酶-底 物复合物的形成。
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑 制剂与底物浓度的相对比例（[I]/[S]）
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HOOC—CH2—CH2—COOH
FAD
MBH2甲烯白（无色）
草酸
琥珀酸脱氢酶 HOOC—COOH
HOOC—CH=CH—COOH
FADH2
MB甲烯蓝（蓝色）
在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢 酶活性的改变。
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实验器材与试剂:
（一）试剂 pH=7.4的磷酸缓冲液 0.25%琥珀酸钠溶液 0.5%草酸钠溶液 0.01%甲烯蓝溶液
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思考题：
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5：本试验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺 陷与改进方案？
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补充：
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琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简 称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶， 属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢 纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需 氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标 志酶。 琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受 体的，另一种是作用于所有受体。
0.50
——
0.50
2.00
0.50
——
0.50
0.50
0.50 —— 1.00 0.20
2.00 —— 1.0 0.20
2.00 1.00 0.20
2.00 1.00 0.20
1.50 1.00 0.20
摇匀，静臵于37摄氏度的水浴中（此后再勿摇动）注意观察各管的颜色变化，记 录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反应液，观察实验现象并 分析产生该现象的原因。
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琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
由PowerBar模板组提供
实验目的：
(1) 学习动物的处死与组织匀浆的方法。 (2) 学习离心机的使用方法。
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(3) 进一步理解酶的竞争抑制原理。
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实验原理：
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竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞 争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的 抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。 草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争 性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。 在体内，琥珀酸脱下的2H 经电子传递链传递，最后与氧 结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色） 作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被还原为甲 烯白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的 快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色 消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。
分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml
搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟
将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢 酶的肝糜液
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实验操作：
另取中试管5支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定
编号 1 2 3 4 5
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0.25%琥珀 酸钠溶液 /ml
0.5%草酸 钠溶液/ml 蒸馏水/ml 肝糜液/ml 甲烯蓝/ml
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生理盐水
液体石蜡
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实验器材与试剂：
（二）器材 研钵.手术剪.手术镊子
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2mL移液管
1000 uL微量可调仪器
10mL离心管
低速离心机
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实验操作：
(1)肝糜液的制备 用颈椎脱臼法处死小白鼠
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将肝脏取出臵于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充 分研磨至糊状
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2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 以铁氰化钾[K3Fe（CN）6]和琥珀酸钠为底 物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为 亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与 Fe3＋作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸 光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱 氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活 力愈强。
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注意事项：
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1>肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢 酶尽量释放到溶液里
2>离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要 相等的离心管对称放臵
3>离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振 荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊
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思考题：
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1:为什么反应开始后，反应液必须静止，不能在 摇动?
避免空气中的氧接触反应溶液，使的还原性的甲 烯白重新氧化成甲烯蓝
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思考题：
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2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本 实验成功的关键是什么？
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思考题：
3：抑制剂还可以选用什么物质？ 还可以选用丙二酸
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4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点 ？ 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物 ；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部 位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大； 但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参 数：Km值增大，Vm值不变。
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琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种
1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法
3.TTC（氯化三苯四氮唑）法
4.MTT法 5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法
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1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
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琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二 甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化 琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光 度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①Succinate＋ PMS→Fumarate＋PMSH2；②PMSH2＋DCPIP→PMS＋ DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这 种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化 与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出 SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧 化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算 SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定）/标准 =μmol/min/mg。