琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制

0.50
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0.50 —— 1.00 0.20
2.00 —— 1.0 0.20
2.00 1.00 0.20
2.00 1.00 0.20
1.50 1.00 0.20
摇匀，静臵于37摄氏度的水浴中（此后再勿摇动）注意观察各管的颜色变化，记 录各管颜色消退的顺序和时间，分析原因，振荡褪色的反应液，观察实验现象并 分析产生该现象的原因。
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注意事项：
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1>肝脏一定要充分研磨至糊状，一使琥珀酸脱氢 酶尽量释放到溶液里
2>离心时注意离心管一定要精确平衡，并将重要 相等的离心管对称放臵
3>离心结束后拿取离心管时动作要轻柔，不要振 荡离心管，以免肝糜液重新变浑浊
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思考题：
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1:为什么反应开始后，反应液必须静止，不能在 摇动?
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生理盐水
液体石蜡
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实验器材与试剂：
（二）器材 研钵.手术剪.手术镊子
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2mL移液管
1000 uL微量可调仪器
10mL离心管
低速离心机
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实验操作：
(1)肝糜液的制备 用颈椎脱臼法处死小白鼠
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将肝脏取出臵于研钵，用生理盐水洗净，剪碎肝脏充 分研磨至糊状
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思考题：
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5：本试验在设计上存在某些缺陷，指出存在的缺 陷与改进方案？
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补充：
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琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简 称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶， 属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢 纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需 氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标 志酶。 琥珀酸脱氢酶有两种，一种是以泛醌作为受 体的，另一种是作用于所有受体。
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2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法 以铁氰化钾[K3Fe（CN）6]和琥珀酸钠为底 物，使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为 亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6]，K4Fe（CN）6再与 Fe3＋作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸 光值，以检测普鲁士蓝之生成量，作为琥珀酸脱 氢酶的还原力，吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活 力愈强。
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琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
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实验目的：
(1) 学习动物的处死与组织匀浆的方法。 (2) 学习离心机的使用方法。
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(3) 进一步理解酶的竞争抑制原理。
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实验原理：
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竞争性抑制是指分子结构与底物相似的抑制剂可与底物竞 争性结合酶的活性中心，抑制酶的活力。竞争性抑制剂的 抑制程度取决于抑制剂与酶的亲和力及与底物的相对比例。 草酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争 性抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸。 在体内，琥珀酸脱下的2H 经电子传递链传递，最后与氧 结合生成水，并释放出能量。在体外则可用甲烯蓝（蓝色） 作为受氢体，甲烯蓝接受琥珀酸脱下的2H 而被还原为甲 烯白（无色）。在甲烯兰含量一定的条件下，蓝色消退的 快慢程度可指示琥珀酸脱氢酶的活力，因此，可依据蓝色 消退时间来判断该酶活力被抑制的程度。
避免空气中的氧接触反应溶液，使的还原性的甲 烯白重新氧化成甲烯蓝
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思考题：
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2:本实验为何选择肝脏来提取琥珀酸脱氢酶？本 实验成功的关键是什么？
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思考题：
3：抑制剂还可以选用什么物质？ 还可以选用丙二酸
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4：利用本实验的数据，说明酶竞争性抑制的特点 ？ 竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物 ；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部 位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大； 但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参 数：Km值增大，Vm值不变。
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琥珀酸脱氢酶活力测定方法目前主要有五种
1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
2.铁氰化钾[K3Fe（CN）6]还原法
3.TTC（氯化三苯四氮唑）法
4.MTT法 5.NBT（氯化硝基四氮唑蓝）法
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1.硫酸甲酯吩嗪（PMS）反应法
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琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS（吩嗪二 甲酯硫酸盐），DCPIP（2，6-二氯酚靛酚）等发生反应催化 琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光 度计检测即可加以定量反映，其反应式为：①Succinate＋ PMS→Fumarate＋PMSH2；②PMSH2＋DCPIP→PMS＋ DCPIPH2。DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这 种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化 与DCPIP含量成正比，测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出 SDH的活力。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧 化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算 SDH的活性。SDH活性计算：（标准－测定）/标准 =μmol/min/mg。
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二、实验原理
酶的竞争性抑制作用
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抑制剂和底物的结构相似，可与 底物竞争酶的活性中心，阻碍酶-底 物复合物的形成。
抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力以及抑 制剂与底物浓度的相对比例（[I]/[S]）
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HOOC—CH2—CH2—COOH
FAD
MBH源自文库甲烯白（无色）
草酸
琥珀酸脱氢酶 HOOC—COOH
HOOC—CH=CH—COOH
FADH2
MB甲烯蓝（蓝色）
在无氧条件下，以甲烯蓝褪色时间来判断琥珀酸脱氢 酶活性的改变。
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实验器材与试剂:
（一）试剂 pH=7.4的磷酸缓冲液 0.25%琥珀酸钠溶液 0.5%草酸钠溶液 0.01%甲烯蓝溶液
分批加入磷酸缓冲液，边加边磨，总共7ml


搅匀后倒入圆底离心管，离心3分钟
将上清液倒入一支试管中备用，即为含有琥珀酸脱氢 酶的肝糜液
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实验操作：
另取中试管5支，标号 琥珀酸脱氢酶活力的测定
编号 1 2 3 4 5
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0.25%琥珀 酸钠溶液 /ml
0.5%草酸 钠溶液/ml 蒸馏水/ml 肝糜液/ml 甲烯蓝/ml