毛细管电泳

影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度 与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：
2(t 2 t1 ) R W2 W1
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六、影响分离效率的因素—区带展宽
factors influenced the efficiency—band broadening
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5. 添加剂的影响
（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大， 使溶液的黏度增大，电渗流减小。
（2）加入表面活性剂，可改变电渗 流的大小和方向；
加入不同阳离子表面活性剂来 控制电渗流。 加入阴离子表面活性剂，如十 二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表 面负电荷增加，zeta电势增大，电 渗流增大； （3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈， 会降低离子强度，Zeta电势减小， 使电渗流降低。
高效毛细管电泳分析
High Performance Capillary Electrophoresis (HPCE)
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第一节 概 述
Generalization
一、概述 Generalization 二、经典电泳分析法 Traditional electrophoresis 三、高效毛细管电泳分析 法 High performance capillary electrophoresis
二.经典电泳分析
利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方 法和技术叫电泳法或电泳技术。 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、 自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无 法与其他分析相比。
1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm内径石英毛细管 进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本 变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分 析技术——高效毛细管电泳。
1.电渗流现象
当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电 荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界 面形成双电层，二者之间存在电位差。 当液体两端施加电压时，就 会发生液体相对于固体表面的移 动，这种液体相对于固体表面的 移动的现象叫电渗现象。
电渗现象中整体移动着的液 体叫电渗流（electroosmotic flow ， 简称EOF）。
Factors influenced electroosmosis
Байду номын сангаас
四、淌度
Mobility
五、PHCE中的参数与关系 式 basic theory of HPCE
Parameters and relation in HPCE
六、影响分离效率的因素
Factors influenced separation efficiency
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2.HPCE中的电渗现象与电渗流
石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管 内壁带负电荷，形成双电层。
在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴
极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中 的溶液整体向负极移动，速度ν
电渗流。
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一 .概述
在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作 用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现 象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁 移速率不同，可实现分离。 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲 溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血 清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α 、β 、γ 球蛋白； 发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定； 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖
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实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算
电渗流
Lef —毛细管有效长度； teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。
HPCE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；
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生物化学家蒂塞利乌斯
A.W.K.蒂塞利乌斯 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius (1902－1971）
蒂塞利乌斯1925年从事胶体溶液中悬浮蛋白质的电泳分离 研究。曾自制超速离心机测定蛋白质分子的大小和形状,并与 斯韦德贝里合作发表了第一篇论文,报道了测定蛋白质淌度的 新方法。1930年他进一步改进实验手段和装置,发表了关于色 谱法和吸附的论文。1935年改建原有电泳装置,发展了区带电 泳法,大大提高了效率和分辨率。1940年他用自己设计的新电 泳装置成功地分离了血清中蛋白质的4个组分,分别命名为:白 蛋白α、β、γ和球蛋白。该法迅速应用于分离和鉴定各种复杂 蛋白质及其他天然物质的混合物的组成。他因对电泳分析和 吸附方法的研究,特别是发现了血清蛋白的组分而获得1948年 诺贝尔化学奖。
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三、HPCE中影响电渗流的因素
factors influenced electroosmosis 1.电场强度的影响
电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时， 电渗流速度正比于工作电压。
2.毛细管材料的影响
不同材料毛细管的表面电 荷特性不同，产生的电渗流大 小不同；
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柱长增加， • 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔
板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。
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高效毛细管电泳的特点
1.仪器简单、易自动化
电源、毛细管、检测器、溶液瓶
2.分析速度快、分离效率高
在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分 离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数.
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4. 温度的影响
毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。
温度变化来自于“焦耳热”；
焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场 强度成正比。 温度每变化1C°，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～ 3%；
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mobility 淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；
淌度不同是电泳分离的基础。
四、淌度
1.绝对淌度(absolute mobility)μab
无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移 速度，简称淌度。可在手册中查阅。
2.有效淌度(effective mobility)μef
3.操作方便、消耗少
进样量极少，水介质中进行.
4.应用范围极广
有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；
分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等.
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一、PHCE基本原理
Basic principles of PHCE
二、电渗现象与电渗流 第二节 Electroosmosis and electroosmotic 高效毛细管电泳理论 flow 三、影响电渗流的因素 基础
2 DL

ap ELef
2D
;
扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生 物大分子的依据。
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tR n 5.54 Y 1 / 2
2
3.分离度
R 0.177
apVLef
DL
平均
平均
ap1 ap2
2
1.迁移时间（保留时间）
HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱 理论也适用。 Lef Lef Lef L t ap ap E ap V
V—外加电压；L—毛细管总长度；
2.分离效率（塔板数） 在HPCE中，仅存在纵向扩散，σ 2=2Dt
n
apVLef
+ef -ef
阳离子运动方向与电渗流一致； 阴离子运动方向与电渗流相反；
ν
=ν
中性粒子运动方向与电渗流一致；
（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离； （2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性， 如同改变LC中的流速； （3）电渗流的微小变化影响结果的重现性； 在HPCE中，控制电渗流非常重要。
阻 力：F = fν 故： qE = fν
q—离子所带的有效电荷； E —电场强度； ν—离子在电场中的迁移速度；
f —平动摩擦系数 ( 对于球形离子： f =6πηγ；γ —离子的表观液态动力 学半径；η —介质的粘度； )
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所以，迁移速度：
qE q E f 6π
实际溶液中的淌度(实验中测定的)。 μef=∑aiμi
ai —溶质i
的解离度；μi —溶质i 在解离状态下的绝对淌度
3.表观淌度 μap 离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）： ν
ap=μap
E
μap = μef + μeo
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五、HPCE中的参数与关系式
parameters and relation in HPCE
液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流 速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽 较大）。
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5. HPCE中电渗流的作用
电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍； 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： ν ν
+ 0
=ν =ν
电渗流 电渗流 电渗流
+ ν - ν
改变电渗流方向的方法：
（1）毛细管改性 表面键合阳离子基团； （2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细 管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。
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4. HPCE中电渗流的流形
电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式 流动（谱带展宽很小）；
1.纵向扩散的影响
在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ 2=2Dt
由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可 获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。
2.进样的影响
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三.高效毛细管电泳分析
高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了50μm (0.05mm)内径的毛细管,
二是采用了高达数千伏的电压。
• 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减 小了温度效应，使电场电压可以很高。
• 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，
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3. 电解质溶液性质的影响
（1）溶液pH的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密 度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大； pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析 时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。
（2）阴离子的影响
在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中 的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。 缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工 作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电 渗流下降。
3.HPCE中电渗流的大小与方向
电渗流的大小用电渗流速度ν 度μ和电场强度E。即
电渗流表示，取决于电渗淌
ν
电渗流
= μE
0ε
电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即 μ = ε
ξ
ε 0—真空介电常数；ε —介电常数；ξ —毛细管壁的Zeta电势。
ν ν
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电渗流
= ε 0ε ξ E = Lef/teo
（球形离子）
物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。 淌度μ ：单位电场强度下的平均电泳速度。
q E 6π
q — 离子所带的有效电荷； γ — 离子的表观液态动力学半径； η — 介质的粘度；
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二、电渗现象与电渗流
electroosmosis and electroosmotic flow
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一、高效毛细管电泳(HPCE)基本原理
Basic principles of PHCE
电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有 不同的迁移速度，迁移速度与哪些因素有关？ 当带电离子以速度ν 在电场中移动时，受到大小相等、 方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。
电场力：FE = qE