常用的层析方法

常用的层析方法

层析填料是决定拄效的主要因素。填料应具有的性能是不溶于所使用的流动相中，不使欲分离的物质破坏或分解、惰性大，可逆性强，吸附容量大，同时颗粒直径范围要狭．因此在选择填料时事先应对其性能有充分的了解，下面将按常用填料名称分类介绍。

1 硅胶层析

（1）性质

层析硅胶为一多孔性物质，可用通式Si02·xH20表示．它具有多孔性的硅氧环的交键结构，由于其骨架表面具有很多游离(I)、键合(Ⅱ)和键合—活性(III)状态的硅醇基·(silanol)基团它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同时能吸附多量的水分．当加热活化(100一110℃)时，硅胶表面因氢键所吸附的水分能可逆地被除去；但温度升高至500℃时，硅胶表面的硅醇基进一步脱水缩合转变为硅氧烷键即硅氧环表面(A)及稠合环氧环烷(B)，从而丧失了因氢键吸附水分的活性不再具有吸附剂的性质．若用水处理亦不能恢复其吸附活性

加热至1100℃时则结合水失尽．由于硅胶的吸附能力与硅羟基数量有关，因此活化时不宜在较高温度进行，一般在170℃以上即有少量结合水失去．硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅羟基的数目，其次是含水量，它随着水分的增加而降低(表l—3)．若吸水量超过12％，吸附力极弱，不能用作吸附层析，只可用作分配层析的载体．硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均直接影响着层析分离的效果(生产都得测出型号)．另一方面因它具有弱的非特异性吸附，能同样吸附极性、非极性饱和和不饱和分子，所以硅胶具有吸附层析与分配层析的双重性．同时硅胶又是一种弱酸，其表面的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，解离常数为10 -6—10 -8，是一种弱酸性阳离子交换剂，当遇到较强的碱性化合物时，则可因离子交换作用而吸附碱性化合物。

硅胶表面的硅羟基能与各种醇如氰乙醇、正辛醇、聚乙二醇在一定温度下加热脱水后生成单分子键合固定相(Si—O—C型)，与十八烷基三氯硅烷生成烷基化学键合相(Si—O—Si—C 型)．另外用S0Cl2将硅胶表面氯化后，与各种有机铵反应生成具有Si—O—Si≡N键的各种不同极性基团的化学键合相，这大大有助于提高分离选择，在液相色谱中占有极为重要的地位，并普遍用于高效液相层析．

层析硅胶应是中性无色颗粒，由于制备过程中接触强酸，常带有酸性，故在使用前应检查其水浸液的酸度，不低于pH5时才可使用．否则应用水洗至中性，再在110℃活化24h．在特殊情况下，硅胶须经6N*盐酸及氯仿等有机溶剂预洗，除去其中所含的铁离子及有机脂溶性杂质．硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶解性，约为0.01％．当溶液在pH9以上则溶解度急剧上升，此点在选择溶剂时应注意，否则会将流分中溶解硅胶误认为植物成分．硅胶层析有时可以加入一种复合试剂，以改良吸附性能，提高分离效果．通常用硝酸银处理硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用．改良吸附剂制备一般用1—10%复合试剂的水或丙酮溶液，与硅胶混匀，待稍干后于110℃干燥即可．

硅胶层析适用范围广，能用于非极性化合物也能用于极性化合物，如芳香油，萜类，甾体，生物碱，强心甙，蒽酮类，酸性、酚性化合物，磷脂类，脂肪酸，氨基酸以及一系列合成产物等的分离．

(2)层析柱的制备与加样

硅胶装柱一般用湿法，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待内中空气泡除去后，连同溶剂一起倾入层析柱中，层析柱中硅胶段直径与长度之比一般为1：20—30．若硅胶的颗粒较细，而粒度分布范围狭，则可采用短柱(1：5)，这样不仅增大了截面积，而且也增加了样品的载量．硅胶最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段现象，影响分离效果．另亦可采用干法装往，将所需硅胶一次倾入柱中，然后礅紧至硅胶高度不改变为止。欲分离样品与吸附剂的比例约为1：30—60，若作为分配层析比例应加大，主要根据分离物质的难易采确定．

当采用分配层析时，应先将预先选定的固定相溶剂如水、缓冲液或极性溶剂加入硅胶中，一般比例为1：0.5—1较为适中，搅拌混合均匀，倾入预先选定的移动相溶剂中并激烈搅拌，使两相互相饱和达到平衡．层析管中事先放入用固定相溶剂剧裂振摇饱和后的移动相，将上述吸着固定相的硅胶按湿法装柱，不断轻敲管壁，使均匀紧密．另外亦可采用加硅胶于固定相饱和的移动相中，按湿法装柱，然后用固定相饱和的流动相通过硅胶拄，使达到层析时稳定的平衡条件．

样品上柱可采取二种方式，如样品能溶于移动相可用少量移动相溶解，从柱顶加入，尽可能保留加样色带狭，再行展开，如样品难溶于移动相，则可溶于适当的溶剂，拌于干燥硅胶上，待溶剂挥发尽后，加适量的移动相拌匀再上柱。并在上面覆盖一薄层纯净的砂，然后用移动相展开

(3)层析溶剂的选择

层析过程中溶剂的选择，对组分分离关系极大．一般没有可循的规律．通常是根据物质的极性度采用相应的极性溶剂来洗脱．在实际吸附层析中是采用从低极性逐步递增极性的梯度洗脱方式．溶剂的洗脱力随介电常数(表1—4)增高而加大．往往借助于硅胶薄层层析的结果来摸索分离条件，基本上可以套用于柱层析．两者所不同者在于样品与硅胶的用量比例，故通常往层析所用的溶剂比薄层层析展开剂极性略偏小．再者可参阅前人分离同类型物质时所用的溶剂系统条件．如采用分配层析可先用纸层析方法探索分离条件．

(4)硅胶的再生

硅胶的再生一般可用乙醇或甲醇洗涤，除去溶剂，烘干活化处理即可使用．必要时用0．5％氢氧化钠水溶液浸泡洗涤，过滤，水洗，再以5—10％盐酸浸泡洗涤，后用蒸馏水洗至中性，

110℃活化，过筛即可