酶工程第章酶的结构和功能

羧肽酶A活性中心的结构
羧肽酶A催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。 当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨基酸时 （苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），反 应速度很快。但是当有这些较大疏水基团的氨基 酸残基进入亚位点3～6时，就会减低酶对这些底 物的亲和力。说明羧肽酶A对底物的识别和结合 有多个位点。同时，苯丙氨酸是羧肽酶A的竞争 性抑制实验证实，还有一个组氨酸残基的 咪唑基位于木瓜蛋白酶活性中心的催化部位（木瓜 蛋 白 酶 共 有 212 个 氨 基 酸 ， 有 His81 和 His159 两 个 His）。Husain和Lowe用1,3-二溴丙酮修饰木瓜蛋白 酶，在pH5.6，1克当量的试剂完全抑制了木瓜蛋白 酶的活性。对修饰后的酶进行氨基酸分析，发现少 一个组氨酸。在用1,3-二溴丙酮（2-14C）的修饰实验 中，发现修饰剂连接了Cys-25和His-159两个残基， 因此知道了这两个基团之间的距离在 5 以内。这个 结论通过x-光衍射分析法又进一步得到了肯定。
差示标记法
胰蛋白酶的差示标记
胰蛋白酶催化碱性氨基酸的羧基形成的肽键水 解。人们认为在胰蛋白酶的活性中心必有酸性基团 存在。ψ胰蛋白酶（Lys6-Ile7之间断裂成为β胰蛋 白 酶 ； Lys6-Ile7 和 Lys131-Ser132 两 处 断 裂 成 为 α 胰 蛋 白 酶 ； Lys6-Ile7 、 Lys131-Ser132 和 Lys176Asp177三处断裂成为ψ胰蛋白酶）失去了水解碱 性氨基酸的羧基形成的肽键的能力，而保留了一般 的酯酶活性，估计Asp177的β－COOH可能与结 合底物有关（与底物中的碱性氨基酸结合）。
一、酶的活性中心
1．酶的活性中心和必需基团的概念 在酶蛋白中，只有少数特异的氨基酸残基与催 化活性直接相关。这些特异的氨基酸残基可以在肽 链的一级结构上相距较远，但通过肽链的折叠、盘 旋，使它们在空间上接近，形成活性中心（或称活 性部位）。组成活性中心的氨基酸残基有些执行结 合底物的任务，有些执行催化反应的任务。我们把 组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持 整个酶分子构象所必需的侧链基团称为必需基团。
各种类型残基举例
接触残基： R1、R2、R6、 R8 、 R9 、 R163 、 R164 、
R165
非贡献残基： R3、R5、R7
辅助残基： R4
结构残基 ： R10、R162、 R169
2．酶活性中心的拓扑学
酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条 沟槽，形状与底物相近。不同的酶的口袋适合不 同的底物。口袋中有相应的结合残基与底物上的 某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基 团靠近。亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与 疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残 基亲合。
要充分利用高反应性的情况。
（2）差示标记法
这种方法是非特异性试剂标记法的一个发 展。它利用竞争性抑制剂或底物预先占据活性 中心，使非特异性试剂只修饰活性中心以外的 基团，然后透析除去保护剂（即竞争性抑制剂 或底物），再用同位素标记的非特异性试剂修 饰活性中心的基团。经氨基酸分析可知哪些基 团位于活性中心。
羧肽酶A活性中心 的结构示意图
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二、酶活性中心化学基团 的鉴定
常用的方法有:
化学修饰法 反应动力学法 x-光晶体衍射法
1.化学修饰法
酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可 以被化学修饰，如羟基、巯基、咪唑基、氨基、 羧基等。如果一个基团是必需的，则被修饰后 酶活性会大大下降，甚至完全失活。
（1） 使用非特异性试剂 对特殊基团的标记
非特异性试剂可以修饰特定的某种基团， 但不能区分活性中心内部和外部的基团。如果 某种基团只存在于活性中心，而其他部位没有， 就可以用非特异性试剂修饰。
木瓜蛋白酶的非特异性试剂修饰
木瓜蛋白酶（papain）分子中有7个半胱氨酸残 基，其中的6个形成3对二硫键，只有一个以自由巯基 的 形 式 存 在 于 活 性 中 心 （ Cys22-63 ， Cys56-95 ， Cys153-200 ， 自 由 Cys25 ； 编 号 从 N 端 开 始 往 C 端 进 行）。在这种情况下就可以用任何一种硫氢基试剂来 修饰，如用碘乙酸修饰。碘乙酸对木瓜蛋白酶的活性 中心无任何特殊亲和力，但由于这种特殊情况，仍然 得到了巯基的修饰与酶活性的丧失相平行的结果。
酶活性部位微环境的影响
由于酶活性部位微环境的影响，活性中心的基 团对某一非特异性试剂的反应性可能会比活性中心 以外的基团的反应性高或低。如3-磷酸甘油醛脱氢 酶的活性中心的Ser能优先地被14C-碘乙酸标记； 牛胰核糖核酸酶活性中心的His能优先地被碘乙酸 标记，其Lys-41的ε－NH2可优先地被氟二硝基苯标 记。也有些酶活性中心的基团对某种非特异性试剂 的反应性很低。
胰蛋白酶的差示标记
Eyl 和 Inagami 的 实 验 证 明 了 上 述 推 测 。 他 们 用 苯甲脒（benzamidine，C6H5C(=NH)NH2）作为β胰 蛋白酶的竞争性抑制剂，以1-乙基-3-二甲氨丙基碳 二 亚 胺 为 缩 合 剂 （ 1-ethyl-3-dimethylaminopropyl carbodiimide ， C2H5-N=C=N-(CH2)3-N(CH3)2 ） ， 以 甘氨酰胺（glycine amide）为修饰剂，以差示标记法 证明了Asp177是结合底物的一个基团。酶的羧基与 甘氨酰胺以酰胺键结合后几乎完全抑制了酶水解Nα- 苯 甲 酰 基 -L- 精 氨 酸 乙 酯 （ N-α-benzoyl-Larginine ethyl ester）的能力。
酶的活性中心示意图
A、B、C 为活性中心的必需基团
酶分子中氨基酸残基的分类
1960年，Koshland将酶分子中的氨基酸残基或 其侧链基团分成4类：接触残基（直接与底物接触， 参与结合或催化的残基），辅助残基（对接触残基 的功能起辅助作用的残基，也位于活性中心），结 构残基（维持构象的残基，此为活性中心以外的必 需基团），非贡献残基（或称非必需残基，非必需 只是对酶发挥活性而言，它们可能有其他作用，如 识别自身物质、运输、防止降解等）。